猪病毒感染的实验室检测

猪病毒感染的实验室检测 猪病毒感染的实验室检测[/page]猪病毒感染十分常见，猪病毒性感染的检查不仅用于临床确定诊断，也可用于流行病学调查，为猪病毒性疾病的预防和治疗提供科学依据。但由于猪病毒分离培养所要求的条件较高，传统的血清学检测既费时又费事，远不能满足临床需要。近年来，由于许多新技术在猪病毒学中的应用，建立了快速诊断方法，为猪病毒感染的诊断提供了方便。（一）标本的采集标本的正确采集与迅速送检是病毒感染诊断成功的关键。1．标本的采集 依据临床症状、病期及检测的目的为采取不同的标本。标本采集的原则和要求：(1) 早期采集：病程初期或急性期采取标本，标本中含病毒量多，易于检出，故病毒分离标本最好在发病的1-2天内采取。(2) 由感染部位采集：呼吸道感染采取鼻咽部分泌物（如采取鼻咽洗漱液）及痰液，肠道感染采取粪便，皮肤感染采取局部渗出液，脑内感染采取脑脊液；此外，还可采取血液、尿液、唾液、宫颈及阴道分泌物、脱落细胞和活体组织等。(3) 严格尤菌操作：采集标本时应严格无菌操作，避免杂菌污染标本。(4) 血清学诊断标本的采集：应在发病初期和病后2-3周内各取——份血清，双份血清同时进行检测，如抗体滴度升高4倍以上才有诊断意义。2．标本的处理 采取的标本应置人无菌器皿立即送检。对本身带有杂菌的标本，如粪便、咽漱液和痰液等应进行抗生素除菌处理，多用高浓度的青霉素、链霉素和庆大霉素等。对组织细胞标本，有时要将其研磨及用胰酶消化。对不能立即送检的标本，应置人含抗生素的50%甘油缓冲盐水中，低温。下保存送检。若暂时不能检查或分离培养时，应将标本存放在-70℃低温冰箱或液氮罐内保存。为了提高病毒及其成分的检出率，可对标本进行离心沉淀，即先用低速离心去沉渣，取上清液再行高速离心沉淀，这样可将病毒浓缩集中，提高检出率。（二）病毒体的检测1．镜检 在光镜或电镜下，尤其是在电镜下，不仅能直接观察及检測病毒的形态与结构，也能鉴定病毒。如采用免疫标记法，可提高镜下检出率。此外，观察细胞内有无包涵体的出现，也是检测病毒感染的指标之一。电镜下观察病毒常用磷钨酸进行负染色。镜检是快速检测病毒的方法之一。2．分离培养与鉴定 由于病毒只能在活细胞内复制增殖，所以应根据病毒的不同，选择敏感动物、鸡胚或离体组织与细胞，分别进行动物接种、鸡胚接种、组织培养或细胞培养来分离培养病毒。目前，实验室最常用的是细胞培养，常用的细胞有原代细胞、二倍体肾细胞、传代细胞细胞等。病毒在细胞中增殖的指标有：①细胞病变效应(CPE)。多数病毒在细胞内增殖，可引起细胞形态学改变，称为细胞病变效应。常见的病变为细胞变圆、坏死、溶解和脱落，有的细胞内出现包涵体，如狂犬病毒。②红细胞吸附现象。流感病毒和副流感病毒感染的细胞膜上出现病毒基因编码的抗原，可以与红细胞结合。若向培养瓶内加入红细胞，可见红细胞吸附于细胞膜上，这种现象称为红细胞吸附现象。新分离的病毒，根据临床症状和病毒的特性（包括易感宿主动物范围、细胞病变特征与红细胞吸附现象等），即可初步鉴定病毒的科属。进一步分型需用特异性抗体进行血清学鉴定。（三）病毒抗原与相应抗体的检测由于免疫学技术的发展和应用，不仅可以检测病毒的各种抗原，而且还可检测病毒抗原相应的特异性抗体。免疫荧光、免疫酶、放射免疫、蛋白印迹技术、中和试验、红细胞凝集试验、红细胞凝集抑制、间接血凝试验等技术和方法，均可用来检測毒的各种抗原以及相应的抗体，作为病毒性感染的诊断、辅助诊断或病情与病程分析的指标。尤其是酶联免疫吸附试验，因其具有简便、快速、灵敏和特异性高等特点，已广泛用于多种病毒抗原及相应抗体的检测。（四）病毒核酸的检测1. 病毒核酸杂交技术 利用双链DNA可解离和重组合的性质，将一条已知的单链DNA标记上同位素作为探针，与待检标本中的病毒核酸（与探针DNA同源或部分同源）进行核酸分子杂交，这种方法称为病毒核酸杂交技术，，此法可测病毒的DNA，也可测病毒的RNA。目前，常用的核酸交技术有斑点杂交法、Southerm吸印法和Northerm吸印法等。病毒核酸杂交技术的主要用途是：①检测血或组织细胞中的病毒核酸；②观察血清或组织细胞中病毒核酸的分子质量大小；③用于细胞内基的定位及细胞内核酸的定性与定量等+，核酸杂交技术比电镜、免疫电镜、免疫酶标等方法更为特异、敏感和快速。

猪病毒感染的实验室检测[/page]猪病毒感染十分常见，猪病毒性感染的检查不仅用于临床确定诊断，也可用于流行病学调查，为猪病毒性疾病的预防和治疗提供科学依据。但由于猪病毒分离培养所要求的条件较高，传统的血清学检测既费时又费事，远不能满足临床需要。近年来，由于许多新技术在猪病毒学中的应用，建立了快速诊断方法，为猪病毒感染的诊断提供了方便。（一）标本的采集标本的正确采集与迅速送检是病毒感染诊断成功的关键。1．标本的采集 依据临床症状、病期及检测的目的为采取不同的标本。标本采集的原则和要求：(1) 早期采集：病程初期或急性期采取标本，标本中含病毒量多，易于检出，故病毒分离标本最好在发病的1-2天内采取。(2) 由感染部位采集：呼吸道感染采取鼻咽部分泌物（如采取鼻咽洗漱液）及痰液，肠道感染采取粪便，皮肤感染采取局部渗出液，脑内感染采取脑脊液；此外，还可采取血液、尿液、唾液、宫颈及阴道分泌物、脱落细胞和活体组织等。(3) 严格尤菌操作：采集标本时应严格无菌操作，避免杂菌污染标本。(4) 血清学诊断标本的采集：应在发病初期和病后2-3周内各取——份血清，双份血清同时进行检测，如抗体滴度升高4倍以上才有诊断意义。2．标本的处理 采取的标本应置人无菌器皿立即送检。对本身带有杂菌的标本，如粪便、咽漱液和痰液等应进行抗生素除菌处理，多用高浓度的青霉素、链霉素和庆大霉素等。对组织细胞标本，有时要将其研磨及用胰酶消化。对不能立即送检的标本，应置人含抗生素的50%甘油缓冲盐水中，低温。下保存送检。若暂时不能检查或分离培养时，应将标本存放在-70℃低温冰箱或液氮罐内保存。为了提高病毒及其成分的检出率，可对标本进行离心沉淀，即先用低速离心去沉渣，取上清液再行高速离心沉淀，这样可将病毒浓缩集中，提高检出率。（二）病毒体的检测1．镜检 在光镜或电镜下，尤其是在电镜下，不仅能直接观察及检測病毒的形态与结构，也能鉴定病毒。如采用免疫标记法，可提高镜下检出率。此外，观察细胞内有无包涵体的出现，也是检测病毒感染的指标之一。电镜下观察病毒常用磷钨酸进行负染色。镜检是快速检测病毒的方法之一。2．分离培养与鉴定 由于病毒只能在活细胞内复制增殖，所以应根据病毒的不同，选择敏感动物、鸡胚或离体组织与细胞，分别进行动物接种、鸡胚接种、组织培养或细胞培养来分离培养病毒。目前，实验室最常用的是细胞培养，常用的细胞有原代细胞、二倍体肾细胞、传代细胞细胞等。病毒在细胞中增殖的指标有：①细胞病变效应(CPE)。多数病毒在细胞内增殖，可引起细胞形态学改变，称为细胞病变效应。常见的病变为细胞变圆、坏死、溶解和脱落，有的细胞内出现包涵体，如狂犬病毒。②红细胞吸附现象。流感病毒和副流感病毒感染的细胞膜上出现病毒基因编码的抗原，可以与红细胞结合。若向培养瓶内加入红细胞，可见红细胞吸附于细胞膜上，这种现象称为红细胞吸附现象。新分离的病毒，根据临床症状和病毒的特性（包括易感宿主动物范围、细胞病变特征与红细胞吸附现象等），即可初步鉴定病毒的科属。进一步分型需用特异性抗体进行血清学鉴定。（三）病毒抗原与相应抗体的检测由于免疫学技术的发展和应用，不仅可以检测病毒的各种抗原，而且还可检测病毒抗原相应的特异性抗体。免疫荧光、免疫酶、放射免疫、蛋白印迹技术、中和试验、红细胞凝集试验、红细胞凝集抑制、间接血凝试验等技术和方法，均可用来检測毒的各种抗原以及相应的抗体，作为病毒性感染的诊断、辅助诊断或病情与病程分析的指标。尤其是酶联免疫吸附试验，因其具有简便、快速、灵敏和特异性高等特点，已广泛用于多种病毒抗原及相应抗体的检测。（四）病毒核酸的检测1. 病毒核酸杂交技术 利用双链DNA可解离和重组合的性质，将一条已知的单链DNA标记上同位素作为探针，与待检标本中的病毒核酸（与探针DNA同源或部分同源）进行核酸分子杂交，这种方法称为病毒核酸杂交技术，，此法可测病毒的DNA，也可测病毒的RNA。目前，常用的核酸交技术有斑点杂交法、Southerm吸印法和Northerm吸印法等。病毒核酸杂交技术的主要用途是：①检测血或组织细胞中的病毒核酸；②观察血清或组织细胞中病毒核酸的分子质量大小；③用于细胞内基的定位及细胞内核酸的定性与定量等+，核酸杂交技术比电镜、免疫电镜、免疫酶标等方法更为特异、敏感和快速。

2．多聚酶链反应 多聚酶链反应( polyneragechain reaction，PCR)是一种体外基因扩增方法。先将目的DNA变性为单链模板，加两个人丁合成的已变性的单链DNA模板互补的引物。在DNA聚合催化(72℃)下，将单核苷酸从引物3，端开始掺人，沿模板5，—）3，方向延伸，合成DNA新股。标本中只需有少量基因组DNA，经放大后（可放大上万倍）即能检测出病毒序列。此种方法比核酸杂交法敏感、快速，目前已应用到AIDS，甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎等病毒感染的诊断中，取得了较好的效果。