科学养猪-猪传染病诊断

科学养猪-猪传染病诊断 科学养猪-猪传染病诊断[/page]传染病的诊断，是根据流行病学、临床症状和病理变化作出初步诊断，在分析流行病学、临床症状和病理变化的基础上，探讨死因与，病因过程中，应注意各种变化之间的关系，病变新旧、大小与病程发展的关系，局部病变与全身病变的辩证关系，以及病变特征与临诊资料之间的关系等。当前猪病常常是多病原的混合感染和继发感染，造成病变群组合复杂多变，都增加了诊断难度。特别是对新出现的传染病诊断，作为确诊一种新传染病时，分离出来的病原体应当是在发病第一时间出现患病动物的病原体。诊断任何疾病，应当在流行病学调查的基础上，进行临床与病理学诊断，然后需做病原分离、鉴定和血清学诊断、动物试验等，对所获得资料进行综合分析判断，最后才能确诊。为进一步治疗和采取防疫措施，提供科学依据。

一、流行病学诊断

流行病学诊断是在流行病学调查的基础上进行的。由于各种传染病的特点不同，调查的侧重点也不同，通常进行以下四个方面的调查。

1．流行情况调查 发病的时间、地点和传播情况；疫区内病畜的种类、数量、年龄、性别和分布情况；该次流行的感染率、发病率、病死率（致死率）和死亡率。

2．传染源 调查本地过去是否发生过类似的疫病？在何时何地发生过类似疫病？流行情况如何？是否经过确诊？有无历史资料查询？何时采取过何防治措施？效果如何？如本地未发生过类似疫种防治措施？效果如何？如本地未发生过类似疫，附近地区曾否发生？这次发病前，曾否由其他地方引进畜禽、畜禽产品或饲料？输出地有无类似的疫病存在？

3．传播途径和方式的调查 本地各类畜禽的饲养管理方法、使役和放牧情况如何？牲畜流动、收、调拨及卫生防疫情况如何？交通检疫、市场检疫和屠宰检验的情况如何？病死牲畜处理方式如何？有那些助长疫病传播蔓延的因素和控制疫病蔓延的成功经验；全疫区的地理、地形、河流、交通，气候、植被和野生动物、节肢动物等的分布和活动情况，它们与本次疫病的发生和传播有无关系？

4．发病地区的政治和经济情况调查 群众生产和生活的活动情况和特点；畜牧兽医机构的设置和工作情况；发病地区的领导、兽医、饲养员和群众对疫情的看法如何？

二、临床与病理学诊断

疾病的临床症状与病理形态学变化，是机体与致病因子相互斗争的结局，其形成过程是复杂的生物学过程，疾病的症状与病变是客观存在的客体。每种猪病都有相应特定的致病因子，当致病因子用于动物机体后，机体出现一系症状与病理变化，形成的“症候群”与“病变群”具有诊断价值，“症候群“与“病变群”作为诊断疾病依据。

（一）临床诊断

家畜传染病的临床诊断是借助问诊、视诊、触诊、叩诊和听诊等对病畜进行直接检查和对血、粪、尿等进行常规实验室检查。

科学养猪-猪传染病诊断[/page]传染病的诊断，是根据流行病学、临床症状和病理变化作出初步诊断，在分析流行病学、临床症状和病理变化的基础上，探讨死因与，病因过程中，应注意各种变化之间的关系，病变新旧、大小与病程发展的关系，局部病变与全身病变的辩证关系，以及病变特征与临诊资料之间的关系等。当前猪病常常是多病原的混合感染和继发感染，造成病变群组合复杂多变，都增加了诊断难度。特别是对新出现的传染病诊断，作为确诊一种新传染病时，分离出来的病原体应当是在发病第一时间出现患病动物的病原体。诊断任何疾病，应当在流行病学调查的基础上，进行临床与病理学诊断，然后需做病原分离、鉴定和血清学诊断、动物试验等，对所获得资料进行综合分析判断，最后才能确诊。为进一步治疗和采取防疫措施，提供科学依据。

一、流行病学诊断

流行病学诊断是在流行病学调查的基础上进行的。由于各种传染病的特点不同，调查的侧重点也不同，通常进行以下四个方面的调查。

1．流行情况调查 发病的时间、地点和传播情况；疫区内病畜的种类、数量、年龄、性别和分布情况；该次流行的感染率、发病率、病死率（致死率）和死亡率。

2．传染源 调查本地过去是否发生过类似的疫病？在何时何地发生过类似疫病？流行情况如何？是否经过确诊？有无历史资料查询？何时采取过何防治措施？效果如何？如本地未发生过类似疫种防治措施？效果如何？如本地未发生过类似疫，附近地区曾否发生？这次发病前，曾否由其他地方引进畜禽、畜禽产品或饲料？输出地有无类似的疫病存在？

3．传播途径和方式的调查 本地各类畜禽的饲养管理方法、使役和放牧情况如何？牲畜流动、收、调拨及卫生防疫情况如何？交通检疫、市场检疫和屠宰检验的情况如何？病死牲畜处理方式如何？有那些助长疫病传播蔓延的因素和控制疫病蔓延的成功经验；全疫区的地理、地形、河流、交通，气候、植被和野生动物、节肢动物等的分布和活动情况，它们与本次疫病的发生和传播有无关系？

4．发病地区的政治和经济情况调查 群众生产和生活的活动情况和特点；畜牧兽医机构的设置和工作情况；发病地区的领导、兽医、饲养员和群众对疫情的看法如何？

二、临床与病理学诊断

疾病的临床症状与病理形态学变化，是机体与致病因子相互斗争的结局，其形成过程是复杂的生物学过程，疾病的症状与病变是客观存在的客体。每种猪病都有相应特定的致病因子，当致病因子用于动物机体后，机体出现一系症状与病理变化，形成的“症候群”与“病变群”具有诊断价值，“症候群“与“病变群”作为诊断疾病依据。

（一）临床诊断

家畜传染病的临床诊断是借助问诊、视诊、触诊、叩诊和听诊等对病畜进行直接检查和对血、粪、尿等进行常规实验室检查。

“症候群”是动物发生疾病时在临床上出现的各方面异常表现，体温、呼吸、行为血液学和生化学等，许多疾病可出现一系列具有诊断价值的临床症状，称为“症候群”。如某些具有特征性临床症状的典型病例，一般不难作出诊断，如破伤风的“木马状姿势”、狂犬病等。但是对非典型病例和隐性病例，仪依靠临床诊断则难以确诊,一般只能提示可疑疫病的大致范围，必须结合其他诊断方法才能确诊。因此，在进行临床诊断时，常采用类症鉴别的方法进行鉴别诊断，借助实验室诊断和特殊诊断方法确诊疾病和排除疾病，有些疾病还可参考药物治疗。

（二）病理学诊断

猪病病理诊断是运用兽医病理学理论与技术确认猪病的一种手段，其任务是通过尸体病变的检查、识别与判断，对未知的或临诊上难于确诊的单发性或群发性猪病进行病性的确定，以达到诊断疾病和为临诊防治提供依据的目的。病理学诊断通常包括眼观检查和组织学检查（光镜检查和电镜检查），对于具有特征性眼观病理变化的传染病，可以通过病理剖检直接作出诊断、如结核病、猪瘟可以通过病理剖检直接作出诊断、如结核病、猪瘟和口蹄疫等。对于没有特征性眼观病理变化的传染病，通过病理剖检，可以为进一步诊断提供启示和线索。如有些传染病除眼观检查外，还需做病理组织学检查。

“病变群”是某种疾病发生、发展全部过程所出现形态学上的变化。对疾病的诊断，要寻找病变群，一个病例往往代表该疾病的某一个侧面。多个病例才能够全面地、客观地、真实地反映出该疾病全部过程的病理特征，即所谓“病变群”。进一步说，就是同一疾病的典型病变不一定在一个动物身上全部表现出来，只能表现典型病理变化中的某一个阶段，所以很难从这个阶段去判定。又因为病变形成需要时间，所以某一个病理变化只能反映出时间上某一阶段的变化；因此多观察一些病例才具有代表性，即主动有目的去发现“病变群”，为诊断疾病提供依据。根据剖检时所获得的资料，作出病理解剖学诊断。最后在全面观察和综合分析的基础上分析病因，作出疾病的诊断。病理变化的本质，动物机体与致病因子相互斗争结局在形态学上的反应；矛盾主要方面是致病因子，因为没有致病因作用，动物机体则不会发生疾病，疾病名称种类的来源是致病因子（病原微生物、寄生虫、机械和理化学因素）。每种致病因子对动物机体都有其特异性，其出现的临床症状与病理变化具有特异性或特征性，有诊断价值。如猪瘟的淋巴结大理石样病变、脾出血梗灶、大肠扣状肿等。

不同病因引起的猪病，绝大多数具有特异的病变和病变群，尤其生物性病因引起的特异性病变，为临诊上病理诊断提供了依据，如猪瘟、猪丹毒、猪肺疫和仔猪副伤寒等。但是，病变的特异性受病原体的特性与毒力、机体的营养与免疫状态、年龄与品种、饲养管理条件、地理环境与用药情况以及病程快慢等许多因素影响，往往会出现非典型性。此外，当前猪病常常是多病原的混合感染和继发感染，造成病变群组合混乱，都增加了病理诊断的难度。因此，必须强调病理诊断要结合病原学、血清学和临诊学资料进行综合分析。

三、病原学诊断

病原学诊断就是运用兽医微生物学方法检查，这是家畜传染病的主要诊断方法之一。检查结果止确与否与病料采集、包装、送检及检验技术是否适当密切相关。当前猪病常常是多病原的混合感染和继发感染病例增多，一例病料往往分离出多种病原体；给确诊增加了许多困惑，应注意分析判断。

（一）病料的采集

病料力求新鲜，最好能在濒死期或死后数小时内采取，用具、器皿应予灭菌，采病料时应无菌操作。根据流行病学、临诊症状和病理变化能够作出初步诊断时，有目的地采取病料。如怀疑猪瘟时可采取淋巴结和脾脏；口蹄疫、水疱病等，采取水疱皮和水疱液；痘病则刮取结痂；大肠杆菌病、沙门氏菌病魏氏梭菌病等以消化道病变为主的传染病，应采取肠内容物、肠系膜淋巴结；母畜流产，采取其阴道分泌物、有病变的胎盘及流产胎儿。若难以怀疑是何种疫病时，应全面地采集，即采取血、肝、脾、、肺、肾、脑、淋巴结、骨髓和肠内溶物等，同时，要注意采取带有病变的部分作为病料。

（二）显微镜检查

一些病原体，如炭疽杆菌、巴氏杆菌、坏死杆菌、腐败梭菌、钩端螺旋体等具有特征性形态结构，将病料涂片、染色后，用光学显微镜检查，即可较快地作出诊断。有一些病原体，如结核杆菌、副结核杆菌、布氏杆菌等形态特征不明显，但用特殊的鉴别染色法染色，也可迅速得出结论。但对大多数传染病来说，显微镜检查只能为进一步检查提供依据或线索。

电子显微镜负染技术对于某些病毒，特别是轮状病毒、冠状病毒、痘病毒、腺病毒、细小病毒和一些疤疹病毒等引起的传染病，可根据病毒形态结构快速作出诊断。根据需要还可以采用免疫电镜方法进行检查，提高特异性鉴别能力。

（三）分离培养和鉴定

用人工培养的方：袄将病原体从病料中分离出来，并用适当的方法进行鉴定。如分离细菌、真菌、螺旋体等，可选择适当的人工培养基；分离病毒，可选用鸡胚、鸭胚、细胞培养或实验动物接种等方法。对所分离的细菌经形态学、培养特性和生化试验等进行鉴定，对所分离的病毒常用已知的抗血清做血清字试验进行鉴定。

（四）实验动物接种试验

随着组织细胞培养技术的发展，现很少使用实验动物来分离培养病原体（毒），但乳鼠脑内接种法常用于多种病毒的分离培养。利用动物接种法分离病毒适于以下儿方面：①动物接种法比其他分离法敏感时；②感染病毒的动物有特征性的临诊症状（竖毛、兴奋、脑炎、麻痹、震颤等）而死亡时；③培养和分离只能在特定动物体内生长的病毒对；④先将病料接种于动物，使病毒在其体内适应，之后再接种于培养细胞更易于分离培养时；⑤以接种动物的特异性免疫应答为指示，间接证明接种病料中有病毒存在时。动物接种方法不同于鸡胚和细胞培养方法，易受多种环境因素的影响，加之实验动物经常携带传染病等问题，有碍于病原体分离，因此需考虑使用SPF动物或无菌动物。

四、血清学诊断

血清学诊断法常用于可疑病例的确诊或对某种病原体感染程度进行检测。它是用已知抗原来测定被检动物血清中的特异性抗体，或用已知抗体（免疫血清）来鉴定被检材料中的抗原。常用的血清学验有以下几种：

（一）沉淀试验

适量的可溶性抗原和相应抗体，在溶液和凝胶中结合后，形成特异的、肉眼可见的不溶性复合物，称为沉淀反应。利用该反应进行的血清学试验，称为沉淀试验。根据操作方法不同，可将沉淀试验分为环状沉淀试验、絮状沉淀试验、琼脂扩散沉淀试验（单向单扩散、单向双扩散、双向单扩散、双向双扩散）、免疫电泳、对流免疫电泳、火箭电泳和放射火箭电泳等。

（二）凝集试验

某些病原微生物和红细胞等颗粒性抗原与相应抗体结合后，在适量电解质存在的情况下，出现肉眼可见的凝集小块，称为凝集反应。根据这一原理建立的凝集试验，在临床免疫学检验中应用颇多。如直接凝集试验（玻片法、玻板法、试管法），间接凝集试验（间接红细胞凝集试验、间接乳胶凝集试验、间接碳凝集试验），．病毒血凝和血凝抑制试、抗球蛋白凝集试验等。

（三）病毒中和试验

病毒与相应的抗体相结合时，抗体可阻止病毒吸附于宿主细胞，从而抑制病毒感染组织培养细胞或活体细胞，这种反应称为病毒中和试验，这种抗体称中和抗体。培养的细胞、鸡胚和实验动物均可用作宿主细胞。用培养细胞做病毒中和试验时，以细胞培养物是否出现细胞病变、能否吸附红细胞及蚀斑减少等作为指示，测定中和抗体。用鸡胚做病毒中和试验时，以鸡胚的生死和羊水、尿囊液是否具有红细胞凝集性及绒毛尿囊膜上是否生成痘斑作为指示，测定中和抗体。用实验动物做病毒中和试验时，根据动物的生死和发病作为指示，测定中和抗体。病毒中和试验用于多数病毒性疾病的诊断也可用于病毒的鉴定。

另外，病毒中和试验用于毒素与抗毒素检测，将抗毒素和相应毒素以适当比例混合后，接种于易感实验动物。通过观察能否保护易感动物免于死亡或有无毒性反应出现，可鉴定产气荚膜梭菌等毒素.

（四）补体结合试验

补体结合试验是可溶性抗原和相应的抗体结合时，补体非特异性地结合于抗原抗体复合物而被消耗。这种反应肉眼见不到，要以绵羊红细胞和溶血素（抗绵羊红细胞抗体）作为指示系统共同孵育，根据有无溶血现象出现，检查被检系统中有无相应的抗原抗体存在的一种血清学试验。常用已知抗检測未知血清，也可以用已知血清检测未知的相应抗原。如果不出现溶血反应，则补体结合反应结果为阳性。这种方法广泛应用于细菌、病毒、立克次氏体及原虫等引起的各种家畜传染病诊断。

（五）与标记抗体有羊的试验

包括荧光抗体试验( FAD)、酶联免疫吸附试验( EIISA)。

1．荧光抗体试验 将抗体或抗原标记上荧光素（常用的主要有异硫氰酸荧光黄、四乙基罗丹明等），与相应的抗原或抗体发生特异性结合，在荧光显微镜下可看到发出荧光的抗原—抗体反应，从而可对标本中相应抗原或抗体进行鉴定和定位.

2．酶联免疫吸附试验.是根据抗原抗体反应的特异性和酶催化反应的高度敏感性，而建立起来的免疫检测技术，分为固相酶联免疫吸附试验和酶免组织化学技术。

EI+ISA法具有极高的敏感性，常用于抗原和抗体检测，其应用于细菌、病毒真菌或寄生虫等疾病的诊断。酶免疫组织化学技术是利用酶标记抗体作为组织或细胞内抗原或抗体定位的标记物，在光镜下进行细胞（涂片、压片及培养细胞）或普通组织Cr片抗原或抗体定位。

（六）单克隆抗体的应用

利用免疫动物制备的抗体属于多克隆抗体，常因不只针对一种抗原决定簇而影响血清学试验的特异性。而应用淋巴细胞杂交瘤技术制备的单克隆抗体是针对单一抗原决定簇的抗体，由于它具有特异性强、敏感性．高、质量稳定和易于标准化等优点，越来越多地代替前者而被用于家畜传染病的诊断。

五、变态反应诊断

迟发型变态反应是一种检查细胞免疫的有效方法，常用于临床诊断。结核菌素皮内变态反应是其中一个典型例子。感染结核菌的牛于皮内接种结核素（结核菌培养滤液），经72h后根据皮肤炎性应程度对牛结核菌病作出诊断。变态反应诊断方法常用于鼻疽、副结核病、布氏杆菌病和弓形体病等。变态反应诊断法具有操作简单、特异性较高的优点。

六、分子生物学诊断

分子生物学诊断又称基因诊断，主要是针对不同病原微生物所具有的特异性核酸序列和结构进行检测。在传染病诊断方面，具有代表性的技术主要有：核酸探针、核酸电泳和PCR技术。

（一）核酸探针技术

核酸探针技术是近年来发展起来的通过DNA分子杂交检测核酸的新技术。它是根据2条单链DNA（或DNA与RNA）之间互补碱基序列能专一配对的原理进行的，因而具有高度的敏感性和特异性。一般利用已标记的某种DNA（或RNA）片段作为探列进行检测。该方法有三大组成部分：①待检核酸；②固相载体（NC硝酸纤维膜或尼龙膜）；③用同位素、酶或荧光标记的核酸探针。

核酸探针技术有：原位杂交（直接在组织切片或细胞涂片上进行杂交反应）；斑点杂交（将待检的核酸或细胞裂解物，经过变性后直接点在固相膜上进行杂交反应）；Southern杂交（将待检DNA经内切酶消化、琼脂糖凝胶电泳后，转移到固相膜上进行杂交反应。

Northern杂交（方法与Southern杂交基本相同，但待检的是RNA）。探针材料是取自已知病原微生物的核酸片段、已知DNA（或cDNA）核酸片段或者根据已知病原微生物核酸序列设计并人工合成的特异性聚核酸片段，总之探针核酸是已知的。然后将其标记上同位素、地高辛、生物素等制备成探针。固定在支持物上的模板核酸与探针经过变性、复性，根据碱基配对原则，如果模板核酸与探针核酸同源，则两者合，否则两者不发生结合。

利用放射自显影或酶底物反应方法，在固相压的相应位置可见预期条带，进时-可作出准确诊断，基因探针方法敏感性高，特异性强，简便快速，百以从混合标本中正确鉴定出目的病原微生物

核酸探针技术目前主要应用于以下几个方面：①对病毒、细菌、支原体、立克次体、寄生虫和原虫等病原均能作出快速准确诊断；②在混有大量勇菌或混合感染样品中直接检出主要病原，包括难以在体外培养的病原；③检出带菌、带毒等隐性感染动物；④可对病原微生物进行准确分类鉴定；⑤可对动物产品或食品进行卫生检验。

（二）核酸电泳技术

即将提取的病原体核酸进行电泳的方法，也可用于病原学诊断。这种方法一般适用于病原分离和鉴定之后，可区别同一血清型不同亚型。如具有分段RNA基凼组的轮状病毒，叫用此方法区别亚型。另外，双链DAN病毒如疱疹病毒，将其提纯物用限制性内切酶处理后进行电泳，根据其片段不同可区别血清型。在病原细菌，提取质粒后进行电泳，根据其大小和数量进行分析和比较，可区别未知血清型和耐药性，也可用于多发疾病的感染途径等流行炳字分析。

（三）PCR技术

PCR技术又称基因体外扩增技术。根据已知病原微生物特异性核酸序列（目前可以在因特网GeneBank中检索到很大一部分病原微生物特异性核酸序列），设计合成与其5，端同源、3，端互补的2条引物，在反应管中加入待检的病原微生物核酸（称为模板DNA）、引物dNTP和具有热稳足性的碱基DNA聚合酶。在适当条件（Mg2+，pH等）下，置于自动化热循环仪（PCR仪）中，经过变性、复性、延1甲二柙反应温度，此为一个循环，每次扩增可进行20-30个循环。如果待检的病原微生物核酸与引物上的碱基匹配，合成的核酸产物就会以2n（／，为循环次数）指数形式递增。产物经琼脂糖凝胶电泳，可见到预期大小的DNA条带，根据电泳结果可作出确切诊断。PCR技术具有高度敏感性和特异性，方法检测。另外，PCR技术为检测那些生长条件苛刻、培养困难的病原体，为潜伏感染或病原核酸整合到感染动物体细胞基因组的病原体检疫，提供了极为有效的手段。PCR技术与其他分子生物学诊断技术组合，形成了限制性片段长度多态性( PCR-RFLP)、反转录PCR ( RT-PCR)，单链构象多态性( PCR-SSCP )、随机扩增多态性DNA ( RAPD)等技术。

1。限制性片段长度多态性 将PCR方法扩增的DNA片段，用限制性内切酶进行酶切后，经电泳比较酶切片段的方法。电泳后还可以利用DNA杂交技术进一步分析。

2．反转录PCR 利用反转录酶将RNA翻转录成cDNA后，用常规的PCR方法扩增特异性片段。这种方法可扩增出mRNA或RNA病毒基因组中特异性片段。

。 3．单链构象多态性 将双链DNA片段变性后成为单链时，单链DNA靠自身碱基序列形成立体结构。这种DNA在非变性聚丙烯酰胺凝胶中边加热边电泳时，根据其立体结构的差异，即使是长度相同但立体结构不同的DNA片段，其电泳位置也不同。

该方法可检出数百个碱基序列的DNA片段中只有一个碱基差异的不同DNA片段，故非常敏感。

4．随机扩增多态性DNA 这种方法是利用随机引物或病原体基因组中的重复序列或某生物种中常见基因的特异性引物进行PCR，其结果扩增出不同长度的DNA片段，根据其片段长度鉴定病原体和血清型。

综上所述，传染病的每一种诊断方法都有其特定的作用和使用范围，单靠某一种方法不能把所有的传染病和带菌（毒）动物都检查出来，有些传染病应尽叮能应用几种方法进行综合诊断。相信随着科学技术的发展，家畜传染病的诊断水平必将得到进一步的提高。