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泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)是我国重要的淡水经济鱼类之一，因其肉质鲜美，营养价值丰富，而深受消费者喜爱。

近年来，随着养殖面积的扩大，病害发生也愈加频繁，严重制约了泥鳅养殖业的发展。

泥鳅病害主要为泥鳅出血病、泥鳅腐皮病、泥鳅溃疡病等，致使其发病的病原菌主要有维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)和腐败希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens)等，其中维氏气单胞菌感染所引起的病例占比较高。

维氏气单胞菌是一种条件致病菌，能够产生溶血素、气溶素、细胞毒性肠毒素等；相关研究表明，该病原菌在环境胁迫或条件合适的情况下，可引起如罗非鱼(Oreochromis niloticus)、黑鲈(Micropterus salmoides)、鲫(Carassius auratus)和泥鳅(M. anguillicaudatus)、黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)、锦鲤(Cyprinus carpio)等经济类鱼种的感染性菌血症和溃疡性疾病，并给水产养殖业造成了巨大经济损失。

我国在水产养殖动物细菌性疾病的防治中主要使用化学药物防控，而过度使用此类药物容易使细菌耐药性增强，造成水体污染、药物残留等问题。

近年来，生物防治成为研究热点，拮抗菌以其无残留、绿色安全等优点逐渐替代化学药物， 得到越来越多的关注。

针对气单胞菌的生物防治国内外已有报道，KEEREELANG等发现在饲料中添加植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)可以提高黑野鲮(Labeo chrysophekadion)对嗜水气单胞菌(A. hydrophila)的抗病能力。

陆婷巍等从泥鳅养殖地中分离出一株对杀鲑气单胞菌(A. salmonicida)有抑菌活性的解淀粉芽孢杆菌(B. amyloliquefaciens)X8。

而目前国内外对维氏气单胞菌拮抗菌的主要集中在研究耐药性、抑菌谱、动物安全性以及生长条件等部分生物学特性的探究，对抑菌机理以及生产应用方面研究较少。

本试验从泥鳅养殖池塘底泥中分离筛选获得了一株对维氏气单胞菌LCB-1有较好抑菌作用的芽孢杆菌J2-2，并对抑菌活性物质进行了初步分析，提高了泥鳅的抗病能力，以期为泥鳅水产养殖中维氏气单胞菌病的生物防治以及相关生物制剂的开发奠定基础。

维氏气单胞LCB-1(由实验室前期从公安泥鳅养殖池塘患病泥鳅中分离获得，登录号：OQ781151)、嗜水气单胞菌N-2、杀鲑气单胞菌(A. salmonicida)HY-2、米尔伊丽莎白菌(E. miricola)WQ1、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)YQW3、迟缓爱德华菌(Edwardsiella tarda)UP23现由长江大学动科院水产研究实验室提供。

OMEGA DNA细菌基因组购自上海朗顿生物科技有限公司；细菌鉴定引物购自华大基因股份有限公司；无菌脱纤维羊血购自比克曼生物公司；扫描电镜VEGA 3 SBU；酶标仪SENSE425-301.

5%绵羊血琼脂平板：蛋白胨10 g，牛肉膏蛋白胨5 g，氯化钠5 g，琼脂15 g，蒸馏水1 L，无菌灭菌冷却至50 ℃左右时加入体积分数5%无菌脱纤维羊血，混匀；Luria-Bertani(LB)培养基：蛋白胨10 g，氯化钠10 g，酵母提取物5 g，蒸馏水1 L。

从湖北公安县泥鳅养殖基地的池塘中采取表层底泥样品，称取10 g倒入灭菌锥形瓶中，并在瓶中加入90 mL无菌水，混匀制备悬浊液。

采用平板稀释法，将混浊液分别梯度稀释获得浓度为10-5、10-6、10-7的样品溶液，移取0.1 mL均匀涂布于LB固体培养基中。

置于28 ℃恒温培养箱培养24 h后，挑选不同形态、颜色、大小的单菌落平板划线，进行分离纯化。

初筛：以维氏气单胞菌LCB-1为指示菌株，采用滤纸片法对拮抗菌株进行初筛。

之后将指示菌株菌液浓度培养至1×107 CFU/mL，取100 µL均匀涂布于LB固体培养基上，再分别吸取5 µL浓度为1×107 CFU/mL的拮抗菌菌液点种，每个重复3次，于28 ℃恒温培养箱培养24~48 h，记录抑菌圈的大小，挑选抑菌圈直径大的菌株为后续研究菌株。

复筛：采用牛津杯法对上述抑菌圈直径大的分离菌株进行复筛。

参照初筛制备菌液的方法，将指示菌株菌液浓度培养至1×107 CFU/mL，并取100 µL均匀涂布到LB固体培养基上。

用无菌打孔器打孔，孔直径约6 mm，每个孔加入50 µL的分离菌株菌液，重复三次。

置于28 ℃恒温培养箱培养24~48 h，观察并测定抑菌圈直径，选定目标拮抗菌株。

形态鉴定：将菌株J2-2划线于LB平板，28 ℃培养48 h，观察菌落的形态、大小、表面、湿润度等。

挑取平板上的单菌落，经涂片、固定和革兰氏染色，显微镜下观察菌体形态。

分子鉴定：严格按照Omega生物细菌基因组DNA提取试剂盒的操作步骤进行。

将获得拮抗菌的细菌基因组DNA作为模板，采用通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)进行PCR扩增。

参考王亚军等的扩增的体系和程序，将PCR扩增产物送至华大生物工程股份有限公司进行测序，所获序列在NCBI中经BLAST进行同源性比较分析，利用MEGA X构建系统发育树。

参考初筛方法，采用滤纸片法对常见鱼类致病菌的抑菌谱进行测定，测定拮抗菌的抑菌直径，所用指示菌包括：维氏气单胞LCB-1、嗜水气单胞菌N-2、杀鲑气单胞菌HY-2、米尔伊丽莎白菌WQ1、哈维弧氏菌YQW3、迟缓爱德华菌UP23。

参考王倩楠等的方法，将拮抗菌培养至1×107 CFU/mL，取100 μL稀释菌液，均匀涂布于LB固体培养基上，用K-B纸片扩散法检测拮抗菌株对青霉素、氨苄西林等15种抗生素的敏感性。

根据杭州滨河微生物试剂有限公司的《纸片法药敏试验抑菌圈直径判断标准》判定拮抗菌对各种抗生素的耐药性。

发酵产物抑菌试验：将拮抗菌株接入LB培养基中，30 ℃ 转速为180 r/min培养48 h并用0.22 μm无菌滤器进行过滤。

取200 mL无菌滤液冷冻干燥并最终溶于10 mL无菌水中保存备用。

采用牛津杯法测定发酵产物对维氏气单胞菌的抑制作用。

分别将浓缩发酵液按体积倍比稀释至5个梯度(0、2、4、8、16、32倍)并取100 µL放入孔中，根据其抑菌圈直径评估其抑菌作用。

发酵产物与维氏气单胞菌共培养：将维氏气单胞菌培养至1×107 CFU/mL，加入不同比例稀释的浓缩发酵液继续培养。

分别于0、2、4、6、8、10、12 h取100 µL，用酶标仪检测600 nm波长下的吸光值，绘制生长曲线。

以同浓度等体积的维氏气单胞菌单独培养作对照组。

扫描电子显微镜(SEM)观察：将维氏气单胞菌LCB-1和拮抗菌株分别培养至1×107 CFU/mL。

取2 mL维氏气单胞菌液加入到1 mL拮抗菌株的无菌滤液中，对照组则加入等体积LB培养基。

30 ℃摇床培养1 h 后，离心去上清，2 mL 2.5%的戊二醛固定样品6 h后，用1 mL 30%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇以及无水乙醇按次序分别梯度脱水1次，每次脱水15~20 min。

最后干燥、涂片、喷金，观察。

溶血性实验：采用滤纸片法，以5%绵羊血琼脂平板为培养基，吸取5 µL菌液浓度为108 CFU/mL拮抗菌株菌液点种。

置于28 ℃培养箱，24 h后观察溶血情况。

拮抗菌株对泥鳅的急性攻毒实验：活化的拮抗菌株接种至50 mL LB培养基在30 ℃摇床培养24 h。

设3个试验组和1个对照组，每组重复三次，并在每箱入10尾泥鳅。

处理组分别腹腔注射终浓度为1×107、1×108、1×109 CFU/mL的100 µL拮抗菌菌液，对照组注射相同体积的LB溶液，连续7 d观察并记录泥鳅的存活状态。

拮抗菌株对泥鳅的保护性评价：参考王琳晶等的方法并进行改善。

将拮抗菌株和维氏气单胞菌LCB-1分别培养至107 CFU/mL。

处理组腹腔注射50 µL(107 CFU/mL的拮抗菌菌液)+50 µL(107 CFU/mL的维氏气单胞菌液)的混合液，对照组分别注射50 µL(107 CFU/mL的拮抗菌菌液)+50 µL(LB)、50 µL(107 CFU/mL的维氏气单胞菌液)+50 µL(LB)，连续7 d观察并记录泥鳅的存活状态。