文 | 卿羽飞

编辑 | 卿羽飞

前言

鲟鳇鱼是地球上现存最古老的脊椎动物，包括鲟属鲟鱼和鲟鱼属共2属21种，其中我国拥有8种，是鲟鳇鱼分布较多的国家｡

近年来，随着养殖环境的不断恶化，鲟鳇鱼细菌性疾病发生率不断增加，给这一珍贵物种造成了不可弥补的巨大损失｡

而鱼类的健康状况与其生活的水环境密切相关，水环境中生存着大量的已知和未知的细菌菌群，在水质调控､物质代谢､生态系统稳定及疾病的发生与控制等方面都发挥着重要的作用｡

尽管在养殖水环境中病原菌的丰度较低，但也可能在特定条件下大量增殖，从而导致水产病害暴发｡

因此，为了更好的保护和培育鲟鳇鱼这一珍贵物种，阐明其养殖环境的菌群结构组成是有必要的。

今天，我就带大家一起来通过试验揭开，鲟鳇鱼网箱养殖环境微生物菌群结构及潜在病原菌。

一、材料与方法

试验养殖区平均海拔700m，网箱6m深水温为13—23℃，昼夜温差不超过2℃，pH为6.8—7.2，网箱养殖密度约200尾/网箱，养殖所用饵料为人工配合饲料，每天早晚投喂1次，日投喂率为鱼体体重的0.5%｡

样品随机选取中心稳定养殖的4个鲟鳇鱼品种(中华鲟､施氏鲟､达氏鳇H.达乌尔库斯和大杂交鲟A.schrenckii♂×H.dauricus♀)养殖网箱各3个｡

接着，在每个网箱的四角各设1个采样站位，利用500mL的含0.4mg硫代硫酸钠的无菌水样采集袋采集水深5m处(网箱水深6m)的水样。

接着将各网箱采集的水样混合均匀后装于灭菌容器，4℃运输和保存，样品相关指标的测定和DNA提取在24h内完成｡

样品命名:中华鲟网箱养殖水体样品编号为Z1､Z2和Z3，施氏鲟网箱养殖水体样品编号为S1､S2和S3，达氏鳇网箱养殖水体样品编号为H1､H2和H3，大杂交鲟网箱养殖水体样品编号为D1､D2和D3｡

水质测定需要水温､pH和溶解氧(DO)均在现场进行测定，采用便携式多参数测试仪SG68-ELK-ISM(梅特勒托莱多，苏黎世，瑞士)进行测定，仪器使用前均已校正｡

基因组DNA提取时，则取各网箱养殖水体1L，利用5.0μm滤膜滤去浮游动植物和大颗粒物，再利用0.22μm滤膜截留微生物｡

获得的滤膜样品利用强力水样微生物总DNA提取试剂盒(MOBIO，Carlsbad，CA，USA)提取DNA，用Qubit2.0荧光定量仪(Invitrogen，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)进行定量，提取的DNA样品放置在−80℃冰箱中保存备用｡

PCR扩增采用的是16SrRNA基因V3—V4区的通用引物341F和805R｡

而PCR反应体系总体积30μL，含模板DNA20ng，PCR扩增程序为:94℃，3min;(94℃，30s;45℃，20s;65℃，30s)×5;(94℃，20s;55℃，20s;72℃，30s)×20;72℃，5min｡

所以得到的PCR产物经QIAquickPCR技术纯化试剂盒(Qiagen，杜塞尔多夫，德国)纯化后，专业的平台进行高通量测序，测序得到的原始数据提交到NCBI的SRA数据库｡

产品介绍测序得到的原始数据，首先使用FLASH软件根据序列间的重叠关系将成对的序列拼接成一条序列｡

再运用Cutadapt软件去除测序时加入的引物和接头序列，按照barcode标签序列识别并区分样品｡

然后，使用Prinseq软件对各样品数据质量进行质控过滤，所得各样本的有效数据再经过Usearch软件去除嵌合体以及进行税务经济组(在线传输设备)聚类分析｡

在对OTU代表序列利用核糖体数据库项目(RDP)分类器比对RDP数据库进行物种注释，利用Mothur软件对单样品的微生物多样性(alpha多样性)进行分析，采用QIIME软件计算两两样本间的加权UniFrac距离，用于beta多样性分析｡

在准备好这一切后，从鲟鳇鱼典型致病菌16SrRNA序列设计的特异性引物序列，经过多重比对验证试验后，筛选出3对PCR引物(表1)｡

以所提样品DNA为模板进行常规PCR扩增，扩增后的PCR产物经过纯化后，与pMD18-T载体接连转化至大肠杆菌DH5α中，挑取转化后的阳性克隆子利用QIAGENPlasmidMiniKit(Qiagen，Düsseldorf，Germany)提取质粒DNA，送测序公司验证插入的基因片段是否正确，验证正确后测定质粒浓度并绘制标准曲线｡

将已知拷贝数的质粒作为标准模板，采用LightCycler480II型荧光定量PCR仪(Roche，Rotkreuz，Switzerland)进行实时荧光定量PCR扩增｡

荧光定量PCR反应体系总体积10μL，含2×SGFastqPCRMasterMix5μL，模板DNA10ng｡

荧光定量PCR扩增程序:95℃，3min;(95℃，5s;55/60℃，30s;72℃，45s)×45;72℃，10min｡

熔解曲线条:95℃，1min;55℃，30s;95℃，30s｡所有反应均设置3个重复，每轮反应均以无菌ddH2O代替模板DNA作为阴性对照｡

在实验中，平均值和标准偏差采用Excel软件计算;P-values采用SPSS软件计算，单因素方差分析运用最小显著差异(LSD法);PCoA图､柱状图､热图和韦恩图采用R软件绘制｡

二、结果

鲟鳇鱼养殖水体水质分析从表2可以看出，中华鲟保种中心水库水质良好，水温适合鲟鱼生长，pH呈中性，网箱养殖水体中的DO､和CODMn达到Ⅱ类水质标准，BOD5和TP达到Ⅲ类水质标准｡

中华鲟及其他鲟鳇鱼网箱养殖水体的水质指标含量基本一致，除BOD5外，不同品种鲟鳇鱼网箱养殖水体的水质指标含量不存在显著差异(P≥0.05)｡

鲟鳇鱼养殖水体细菌群落结构特征分析从表3可知，中华鲟､施氏鲟､达氏鳇和大杂交鲟养殖水环境样品中，分别获得有效16SrRNA序列数为51537±3709､66785±13726､56344±19476和58587±7538条，平均每个样品获得OTUs为1163个｡

根据各样品的Good’scoverage指数>99%，可知本次测序结果可以代表样本的真实情况｡

Alpha多样性分析结果表明，大杂交鲟养殖水体的OTUs及ACE要显著高于其他品种，表明大杂交鲟养殖水体中的物种总数较高｡

一般来说，BOD5值越高水质有机物浓度越高，细菌的物种数也会越丰富｡

除此之外，其余Alpha多样性指数(Chaol､Shannon和Simpson)无显著性差异(P≥0.05)，表明各样品间的微生物结构组成基本一致｡

根据weightedUnifrac距离进行PCoA分析，从分析结果可知(如下图)，PCoA图的前3个主坐标可以代表83.1%的变量信息，除其中一个中华鲟网箱养殖水体样品外，其余样品均聚在一起，表明这些鲟鳇鱼养殖水体中的微生物结构和组成十分相似｡

而12个鲟鳇鱼养殖水体样品共获得20个门类细菌(如下图)，不同品种鲟鳇鱼网箱养殖水环境中的优势菌门基本一致，均由变形菌、放线菌、拟杆菌门菌组成｡

这些优势门类，分别占到所有样品序列总数的88.81%—93.94%｡

其中，丰度最高的菌门为变形杆菌，占样品序列总数的35.98%—39.94%，其次是放线菌，占样本序列总数的21.77%—24.70%｡

差异显著性分析结果显示，这些优势细菌门在各鲟鳇品种网箱养殖水体中的丰度不存在显著性差异(P≥0.05)，说明各鲟鳇鱼网箱养殖水体中的微生物结构组成在门水平上基本一致｡

在各鲟鳇鱼品种网箱养殖水体样品中，共检测到224个细菌属，对丰度前50的细菌属进行热图分析(如下图)｡

养殖水体中细菌种群有高达34.77%—58.81%的物种未分类，除此之外相对丰度在2%以上的细菌属主要有产品介绍(3.59±0.97)%､产品介绍(2.38±0.56)%､不动杆菌(2.53±3.33)%､Spartobacteria_genera_incertae_sedis(2.13±0.68)%和Subdivision3_genera_incertae_sedis(2.01±1.91)%｡

同时统计结果显示，这些优势菌属在各鲟鳇品种网箱养殖水体的差异不显著(P≥0.05)，表明在属水平上，各鲟鳇鱼网箱养殖水体中的优势菌属结构组成相似｡

鲟鳇鱼网箱养殖水体细菌群落组成比较分析通过构建韦恩图，来分析不同品种鲟鳇鱼网箱养殖水体样品中所共有的和特有的OTU数目(如下图)｡

中华鲟､施氏鲟､达氏鳇和大杂交鲟网箱养殖水体共有了1059个OTUs，统计分析表明，共有的OTUs序列分别占中华鲟､施氏鲟､达氏鳇和大杂交鲟网箱养殖水体序列总数的99.13%､98.44%､99.21%和99.18%｡

因此，不同鲟鳇鱼网箱养殖水体中的核心菌群是一致的｡

此外，中华鲟､施氏鲟､达氏鳇和大杂交鲟网箱养殖水体中还含有特有的OTUs分别为70､156､43和68个，分别占中华鲟､施氏鲟､达氏鳇和大杂交鲟网箱养殖水体总序列数的0.13%､0.51%､0.08%和0.09%｡

中华鲟及其他鲟鳇鱼养殖水体中潜在病原菌，在本次实验检测的网箱养殖水体样品中共发现鲟鳇鱼病原菌菌属7个，主要包括Aeromonas､Acinetobacter､Chryseobacterium､爱德华西耶拉、黄体球菌、假体和弧菌｡

从表4可以看出，7个潜在病原菌菌属在不同鲟鳇鱼养殖水体中的分布规律较为接近，｡

但是7个潜在致病菌菌属的相对丰度存在显著性差异(P<0.05)，除中华鲟养殖水体中假单胞菌>黄杆菌外，其余相对丰度大小均表现为:Acinetobacter>Flavobacterium>Pseudomonas>Aeromoas>Chryseobacterium>Vibrio>Edwardsiella｡

利用荧光定量PCR对已报道鲟鳇鱼养殖过程中的典型病原菌进行检测｡

从下图可以看出，A.hydrophila在养殖水体中的丰度[(7406±1892)copies/mL]要高于或显著高于(P<0.05)其他病原菌｡

其次为F.columnar[(4889±1649)copies/mL)和P.fluorescens[(3259±1117)copies/mL)｡

所以说在养殖水体中存在着大量的已知和未知微生物，其与水生生物体内寄生的微生物菌群相互作用､相互影响，形成了复杂的细菌-细菌､细菌-宿主互作关系，从而对水生生物的健康成长产生重要的影响｡

而明确养殖环境中的微生物结构组成，将有助于病害控制防治､益生菌筛选及病原菌发病机制研究等｡

结论

在同一水域同一管理条件下，不同品种鲟鳇鱼网箱养殖水体中的细菌组成与丰度基本一致，优势菌门均由变形菌､放线菌､拟杆菌门､疣菌和Planctomycetes组成。

优势菌属为产品介绍､Sediminibacterium､不动杆菌､Spartobacteria_genera_incertae_sedis和Subdivision3_genera_incertae_sedis，表明不同鲟鳇鱼的养殖生态环境管理经验是可以相互借鉴的｡

在鲟鳇鱼网箱养殖环境中，共发现鲟鳇鱼病原菌菌属7个，分别是:Aeromonas､不动杆菌､黄杆菌、爱德华氏菌、黄杆菌属､Pseudomonas和弧菌。

实时荧光定量PCR检测结果显示，在鲟鳇鱼养殖过程中最常见的病原菌A.hydrophila的丰度最高，为(7406±1892)copies/mL，其次F.columnar的丰度为(4889±1649)copies/mL及P.fluorescens的丰度为(3259±1117)copies/mL｡