兔粘液瘤病的血清学诊断【库百科养殖网】

兔粘液瘤病的血清学诊断

李晓福 赵宏伟 （辽宁省昌图县八面城动物卫生监督所 112512）

1 琼脂（糖）免疫扩散试验

该方法既能检测抗原又能检测抗体。由于粘液瘤病毒的抗原成分比较复杂，与相应抗血清进行琼脂扩散试验时可形成多条沉淀线，所以试验应出现三条沉淀线。如果试验血清中含有抗体，三条线中至少有一条弯曲向抗原滤纸条，否则成直线。如果试验血清中含有抗原，则至少有一条弯向标准血清滤纸条。

样品采集。被检兔的全血或血清，并制备琼脂板。

试验方法。将含标准血清和抗原的滤纸条放置于琼脂表面，含被检血清或全血的滤纸条放置于标准血清和抗原中间的琼脂表面上。37℃湿盒中反应24~48小时后判定结果。也可按常规方法进行琼脂免疫扩散试验。

2 补体结合反应

补体结合反应是目前兔粘液瘤病诊断所用的标准方法。应用微量反应板进行补体结合试验采用的是固定抗原，稀释血清的方法。

样品采集。待检兔的血清。

抗原制备。将粘液瘤病毒Lausanne株细胞培养物接种易感兔，6~7天后取粘液瘤样病变组织，用巴比妥缓冲液制成1/5的匀浆，离心后取上清液，加入0.5%氯仿去除补体活性的物质，将抗原用标准阳性血清滴定后置零下70℃冰箱，保存备用。

标准阳性血清是将粘液瘤病毒弱毒株免疫粘液瘤病抗体接种阴性成年兔（www.novmv.com），四星期后再接种一次由Lausanne毒株引起的粘液瘤病病料。三星期后采血，补体结合反应试验测定抗体滴度。如果抗体达到1/640以上，则放血，分离血清，分装后置零下20℃冰箱，保存备用。

标准试剂的滴定。标准血清在6℃水浴灭活30分钟。应用pH值为7.2的钙-镁-巴比妥缓冲液（CMV）倍比稀释参考血清，从1∶2~1∶4 096，应用96孔平底微量滴定板测定。在每行中，每个稀释度加到一个孔，每孔25微升。取试管，用CMV将抗原作倍比稀释，从1∶10到1∶1 280。将稀释的抗原的每个稀释度加到每一纵行的各孔中，从1∶10~1∶1 280，每孔25微升。所有的孔中加25微升补体。用塑料薄膜覆盖反应板，37℃作用1小时或4℃作用14小时。每孔加入致敏红细胞50微升。覆盖反应板，37℃作用30分钟。结果判定：能够使标准血清最高稀释度发生完全溶血的抗原最高稀释倍数作为25微升中该稀释度的一个抗原单位。

补体结合试验。阴性、阳性血清60℃水浴灭活30分钟。应用CMV作为稀释液对试验血清和对照血清进行两倍系列稀释，从1∶4~1∶1 024，使用96孔圆底微量滴定板，每孔25微升。设置抗原、血清、补体和红细胞对照。每孔内加入倍化稀释后的25微升一个抗原单位（除血清、补体、红细胞对照外）。然后加6个H50单位补体，每孔25微升（除红细胞对照外）。用塑料薄膜覆盖反应板，4℃作用14小时（过夜）。每孔加入50微升致敏红细胞。覆盖反应板，37℃作用30分钟。应用补体对照（H100）和CMV制备H100、H75、H50、H25溶血对照。结果判定：当1∶4稀释的阴性血清溶血抑制小于50%时试验成立。经离心或4℃被动沉淀后记录，能够抑制50%溶血的血清最高血清稀释倍数为血清最后试验结果。

3 免疫荧光抗体试验

间接荧光抗体试验在鸡胚成纤维细胞进行，用于粘液瘤病的诊断及流行病学调查。

样品采集。被检兔血清样品。

抗原板的制备。将鸡胚成纤维细胞培养在平底微量滴定板上，37℃在含5%的二氧化碳培养箱中培养24小时（细胞培养成单层）。弃去培养液，每孔加入100微升病毒悬液。两小时后，加入100微升含20%犊牛血清的培养基，37℃在含5%的二氧化碳培养箱中培养48小时。用磷酸盐缓冲液洗涤反应板，并用内含15%蒸馏水的丙酮溶液零下20℃固定30分钟。将培养板置37℃烘干15分钟。培养板置零下30℃至零下70℃可保存3个月。

间接荧光抗体试验。将被检血清作1∶10或1∶20稀释（定性试验），或将血清作系列稀释（定量试验）。按试验要求（定性或定量试验）将稀释血清加入抗原板各自反应孔中，每个血清样品加两孔，每孔50微升，37℃湿盒作用30分钟。用磷酸盐缓冲液洗涤反应孔，更换三次磷酸盐缓冲液，每次洗5分钟。加稀释至工作浓度的异硫氰荧光素标记的羊（其他动物也可）抗兔免疫球蛋白，37℃湿盒作用30分钟。在蒸馏水中轻轻漂洗一下，空气中干燥后，用Elvanol封载剂封固后观察。

如进行流行病学调查，则可将血液吸附到圆形滤纸上，剪下带血迹的滤纸片，放入到微量反应板的孔中，每孔中放两片，加入100微升磷酸盐缓冲液浸出血清（此时，血清的稀释倍数约为1∶30），并取出50微升作另外一孔试验。将发病动物组织病料或细胞培养分离物在玻片上制备印迹或冰冻切片，用特异性荧光抗体染色后镜检，可以确定粘液瘤病毒抗原。