1 引言

白芨属于兰科植物，分布于四川省以下的长江流域及广西云南贵州等省，有紫花三叉白芨和水白芨之分，其品质前者优于后者。野生情况下，大部分生长在土壤湿度大、透气性好且空气湿润的靠荫边斜坡上。药用价值高，主要是下面的茎块，中医用于止血生津，如胃、肺及肠道出血，也用于工业源料。由于人为因素及环境因素影响，资源已逐渐枯竭。药农主要是通过茎切块繁殖，此法母体使用量大，成本高，繁殖速度慢，满足不了市场的大量需求。种子繁殖在自然情况下对环境要求高，成活率低，主要原因是兰科植物的种子属于不完整胚胎，不带坯乳，子房萌芽后后续营养无法跟上，因而萌发后的幼苗很难成活。利用组织培养使种子萌发进行繁殖，其速度快，适合大面积种植，也是目前主要发展方式。试验室主要分三个步骤：即一级苗、二级苗、三级苗，其培养基分别为如下。①一级苗(种子萌发)阶段培养基成分为：1/2MS+6-BA1.0 mg/L+ Naa0.15 mg/L+蔗糖30 g/L +琼脂粉4.8 g/L 其pH:6.0②二级苗(壮苗)阶段培养基成分为：4/5MS+ Naa0.5 mg/L+蔗糖30 g/L +琼脂粉4.9 g/L 其pH:6.2③三级苗(成苗)阶段培养基成分为：4/5MS+ Naa0.5 mg/L+蔗糖30 g/L +琼脂粉5.0 g/L 其pH:6.2+。

2 白芨种子的采摘时间及注意事项

果荚采摘时，挑选形状饱满，色泽光洁的果荚。长江中下流域在处暑与白露之间采摘白芨果实。原因是果实采摘过早，其果荚内的种子成絮状还未完全分离，难以播洒；采摘过晚，果荚容易裂开，无法对果荚进行消毒，也就失去了做组织培养的价值。果荚内没有完全成熟的种子也可以在培养基上成活。

3 组织培养前果荚的处理

为消毒做好准备：在不破坏果荚密封结构的前提下，剪去果荚外一些不需要的东西，如果翼；留置约3 mm果柄，以便播种时方便夹住操作；将处理过的果荚用洗衣粉浸泡，并逐个地用小刷子将果荚外的污垢刷净，清洗晾干备用(一般每人每天的使用量在50枚左右。多余的应装入保鲜袋放进冰箱冷藏保存，及时用完)。

3.1 果荚消毒

果荚的消毒灭菌要在无菌条件下进行。在无菌室中，将清洗过的果荚放入器皿中，加入75%酒精浸泡15 min，且无菌水冲洗3次。再加入0.4%的汞溶液中浸泡20 min，不停地搅拌，使其充分接触溶液达到消毒彻底，之后用无菌水冲洗3次，控干水后放入无菌瓶中，用无菌纸压住，拧紧盖后倒置，使果荚上的残余水份尽可能被吸收。

3.2 播种

准备一个用酒精清洗消毒过的直径8～10 cm小铁盘，用于切割果荚。用消过毒的镊子每次从无菌瓶中取出果荚5～8枚放置于盘中备用，将盛果荚的瓶拧紧放在无菌操作台一边待用。用镊子夹住果荚的果柄，让果荚在酒精灯上灼烧片刻，目的是消毒，注意不要烧热果荚，以免烫伤荚内种子。然后在小铁盘中用手术刀将果荚拦腰切成两段。用镊子夹住断面的另一端，在盛有培养基的瓶口轻轻敲击，让果荚中的絮状种子随着震动而均匀洒落于培养基表面上，每种植完一瓶后，将瓶盖内侧放于酒精灯上灼烧片刻，以达到清毒目的即可，然后拧紧瓶盖。并在瓶的侧面横向四面拍击，使得种子更均匀分布在培养基表面。

4 种子的养护

种子播种后放于培养室中先进行暗培养，室温控制在白天23 ℃，夜晚18 ℃，直至种子萌芽。7 d左右种子吸饱水份，絮状种子开始膨胀。20 d后开始光照，光照时长由6 h逐渐递增至12 h，光照强度由1400LX逐渐递增到2000LX，如果是采用双管照明的，前期可以关闭一只灯管来控制光照。萌芽出的种苗成米白色的细叶芽，经过一段时间的光照，米白色细叶芽转变为嫩绿色。50 d以后便可以分瓶壮苗，培养二级苗。(长期控制种苗的方法:为调节苗木的供需，在一定的时候要控制苗木的生长，关键要：一是控制温度，温度应控制在5～10 ℃之间；二是降低光照强度，光照强度应保持在600～1400LX)。

5 种苗的培养

5.1 第一次分苗

白芨种子因其细小，在播种过程中会过于密集，导致种子萌发后种苗堆集在一起。随着种苗逐渐生长过程中，容器溶液表面积不够，营养基供养分不足，且无法确定其数量。因此须要更换培养基供幼芽养分，让其生根壮苗。要注意的是:①分苗时每夹幼苗数量在2～4株，多于4株会在生长壮大的过程中产生病根现象，会给第二次分苗造成难度；②是注意每瓶数量。以直径7 cm的苗瓶为例，每瓶应控制在120～150株左右，越少越好，但过少会浪费器材且不经济。过密会影响苗的生长；③温度应控制在18～23 ℃，光照强度白天在23 ℃，晚上18 ℃左右。光照时长为12 h，光照强度在2000LX左右，35 d以后便可以进行第二次分苗。

5.2 第二次分苗

当苗长至2～3 cm后，便可以进行第二次分苗。以直径7 cm的苗瓶为例，每瓶应控制在7簇，每簇4株左右，每瓶保持在30株左右。3次分苗后50 d左右，苗的基部开始长出类似于球状的茎块。对于瓶苗来说，苗出瓶后移栽的成活率完全取决于小球在瓶中的生长情况。第二次分苗，培养室的温度白天应控制在25 ℃，晚上20 ℃，光照时长前期为12 h，后期为14 h，光照强度2800LX。

5.3 第三次分苗(即驯化)

第二次分苗后约105 d左右，此进苗的基部大部分都生长有小球，当第一片子叶，和第二片子叶开始枯黄时便可以开瓶进行第三次分苗，移栽入大棚，在大棚环境下进行养护，先进行驯化(炼苗)后，再经过在自然环境的土壤中吸收养分，让种苗逐渐适应在非培养基的自然环境下生长。

5.3.1 炼苗

移栽之前要先炼苗，就是将瓶苗无菌培养室移至室外，打开瓶盖，让种苗在散射光下充分接触空气，适应自然环境，注意不要让苗放在阳光下直接照射。炼苗选择在18～25 ℃时为好，时间一般在4～7 d为宜。

5.3.2 移栽入大棚

先将苗从培养瓶中取出，在清洁的流水下洗净种苗根部的培养基。如仍有2～4株连在一起的簇苗，只要洗净培养基即可，不要将其分开，以免弄伤苗基部小球，影响成活率。栽入苗床以4～5株为一簇，约间隔7 cm，深度以小球不露在外面为准。

5.3.3 育苗大棚

大棚约高2～3 m，应采用双层骨架，即遮阳网在上一层，塑料薄膜在下一层，中间间隔50 cm左右。这样大棚在高温情况下，内外层温度会相差7～10 ℃，利于幼苗生长。

所有统计计算均用SASv 9.13统计分析软件进行。定量数据采用t检验、ANOVA或Wilcoxon秩和检验。定性数据用χ2检验、Fisher精确概率、连续校正χ2检验、或Wilcoxon秩和检验，考虑到中心或其他因素的影响采用CMHχ2检验。对于生存数据采用，Log‐rank检验。主要指标的两两比较，采用95%置信区间（95%CI）法，计算双侧95%CI。全部的假设检验均采用双侧检验，取α=0.05。

种苗移栽结束后应立即用杀菌剂加杀虫剂(用量按药说明书使用)稀释的水浇透，防止因分根破损引起烂根，待幼苗叶干后随即喷一次MS营养液，保证营养助其生新根，提高成活率。每间隔7～10 d喷一次叶面肥，有兰科作物的叶面肥，或中药材专用肥均收到良好效果。如此养护需经过两年，幼苗才能移栽到大田(养护一年的幼苗，经试验成活率不是很高)。第二年养护时大棚可揭去薄膜，但一定要盖上遮阳网防止爆晒，除自然雨水外，平时应关注苗床湿度，不易过干，也不能积水。管理上基本和第一年幼苗相同。

5.4 第四次分苗(移栽入大田)

经过3次分苗后的新苗已经长大，已逐渐适应自然环境，可以移栽入大田生长和管理。长江流域应选择在4月下旬～5月上中旬份(视温度而定，日夜温度应在15～25 ℃左右)。

5.4.1 苗床的准备

大田应在上年冬天进行深耕，并施足腐熟的基肥(人畜肥及油饼均可)，让土壤充分吸收。经过施足基肥的土壤经过霜冻，会疏松透气且减少来年病虫害。栽苗前再进行1次翻挖整理，使垅畦宽度为100 cm，高度为15 cm，排水沟保持畅通，防止苗床积水。

5.4.2 病虫害管理

白芨的病害主要为叶斑病和根枯病。前者症状是叶背面出现粉状黄色斑点，并逐渐扩散严重者导致白芨苗整株死亡。后者表现烂根现象，植株从基部逐渐枯黄直至整株死亡。防治方法主要是每间隔40 d喷1次杀菌剂加杀虫剂。

6 结语

如今组织培养已经成为我国培养白芨的重要方式之一。对于白芨的种子组织培养和种植技术进行深入的研究，能够有效提升我国白芨的繁殖速度以及存活率，从而进一步扩大种植面积。