文丨雨燕的小世界

编辑丨雨燕的小世界

子叶微嫁接是研究子叶在植物早期发育过程中的核心作用的有用工具，特别是它们与其他植物器官在长距离运输方面的相互作用。

虽然下胚轴微移植方法已经成熟，但子叶微移植仍然效率低下。通过优化子叶微移植，我们的目标是提高模式物种拟南芥的成功率和通量。

我们在平坦坚实但潮湿的表面上建立了切割和粘贴子叶手术程序，从而改善了小幼苗的处理。

通过应用特定的切割和连接模式，吞吐量提高到每小时 40 棵幼苗。

短日照周期和低光强度的发芽和长日照加上高光强度、高温和嫁接后的垂直板定位相结合，显著提高了“连接”效率。

特别是高温对成功率产生了有利的影响。总的来说，我们在拟南芥中实现了高达92%的嫁接成功率。

通过通过移植部位运输脉管系统特异性染料来证明脉管系统的重新连接，韧皮部和木质部重联分别在嫁接后3-4天和4-6天以温度依赖性方式完成。

我们观察到具有嫁接子叶的植物在生物量生产和莲座发育中与具有完整子叶的植物相匹配。

这种剪切和粘贴子叶到叶柄微移植方案简化了手术中植物幼苗的处理，增加了每小时嫁接的植物数量，并大大提高了拟南芥幼苗的成功率，所开发的子叶微嫁接方法也适用于其他具有相当大小的植物物种。

自古以来，植物嫁接就已成功应用于园艺和农业目的的各种植物物种。

最近，小植物幼苗的嫁接，通常称为微移植，已成为研究生理反应的有吸引力的工具，这些生理反应依赖于各种物质的器官间长距离运输。

例如，使用微移植研究了小分子，如植物激素、小RNA、小肽/蛋白质、营养素、硫代葡萄糖苷或植物螯合素。

拟南芥的移植在20多年前就被描述，此后被应用于不同的器官，包括花序，子叶和芽/根。

虽然花序茎嫁接和下胚轴微移植的成功率分别高达87%[20]和100%，但子叶微移植的成功率迄今非常低。

尽管存在这种限制，但移植已经成功地应用于揭示子叶在花卉发育中的重要作用。

例如，移动式开花位点T蛋白在子叶中大量产生，并通过韧皮部运输到枝顶分生组织，FT诱导花朵过渡。

尽管子叶在植物发育中的作用及其与其他植物器官的相互作用非常重要，但移植尚未用于其他方法，可能是因为成功率低，迄今为止唯一描述的方法。

由于幼苗及其子叶的微型尺寸，在拟南芥和其他小型植物物种中，嫁接是一个技术上具有挑战性的过程。

通常，子叶不会附着在受体植物的叶柄上，这可能是由生物钟驱动的子叶环形引起的，这可能是成功率低的主要原因之一。

由于拟南芥的枝根下胚轴微嫁接已成为基础植物研究中的成熟方法，我们旨在提供一种优化的cot嫁接方法，以鼓励进一步研究子叶及其在植物生长发育中的重要作用。

因此，我们开发了一种平坦表面子叶到叶柄微嫁接方案，该方案简化了嫁接幼苗的处理，增加了每小时花枝嫁接植物的数量，并为年轻的拟南芥幼苗产生高成功率。

我们开发了基于下胚轴微移植的一般条件在平坦的固体表面上进行的剪切和粘贴COT移植，然后调整移植程序以进行子叶移植。

此外，评价了不同生长条件对嫁接前后移植成功率的影响。

移植前的生长条件

一般来说，微移植推荐无菌条件，使用标准方案对种子进行灭菌，并在4°C下储存至少7天以进行分层。

将种子播种到拟南芥溶液培养基上，在层流罩下不带蔗糖。将植物生长在生长柜中，在不同的光照和日长设置下生长：长日照和短日照作为两种不同的日长。

光强度为30μmol * s−1+ 升−2或 90 μmol * s−1+ 升−2，嫁接前的生长温度始终恒定为20°C。

使用4日龄、5日龄、6日龄和7日龄的植株研究了幼苗年龄对嫁接的影响。

婴儿床移植程序

Melnyk详细描述的一般微移植环境通过一些修改来实现：虽然建议在层流下进行植物手术，但我们在通常的实验室条件下在实验室工作台上工作。

解剖工具 - 细钳和超细微型刀 - 用乙醇灭菌，如果可能的话，所有其他材料在使用前都经过高压灭菌。Motic SMZ168和Zeiss Stemi DV 4被用作解剖显微镜。

将两个圆形滤纸用蒸馏水润湿，并放入无菌培养皿中，去除多余的液体。

将两条Hybond N膜条放置在滤纸的顶部，在微接枝过程中，使用额外的润湿滤纸条来保持最佳湿度水平。

使用细镊子将受体幼苗从培养基板转移到尼龙膜上并尽可能平坦地放置在膜表面上，下胚轴的轻微旋转可以帮助使幼苗平整，在整个移植过程中，小心处理幼苗以防止组织损伤非常重要。

在这些准备步骤之后，在解剖显微镜下进行显微手术，受体植物的两个子叶都通过使用微刀精确切割去除。

接下来，供体植物的子叶被切断，沿中央叶脉进行纵向切割，制备子叶和叶柄之间的直角。

此步骤对于供体子叶自然定向到受体植物至关重要，然后使用镊子将供体子叶直立移植到受体叶柄上。

如果叶柄处的切削刃不能很好地配合，则切掉一小块叶柄以获得供体子叶和受体植物的叶柄之间的拟合角度。手术后，使用石蜡膜M密封培养皿。

将豆冠嫁接的植物在20°C或27°C下转移回生长柜。 为了研究手术后的恢复情况，将培养皿垂直或水平放置。

光强度为30μmol * s−1+ 升−2或 90 μmol * s−1+ 升−2昼长设置为长日或短日条件。

评估婴儿床移植的成功率

移植的子叶在手术后7天进行评估，为了测试嫁接的子叶是否可以拆卸，使用细镊子轻轻移动它。

不可拆卸，因此附着良好的子叶被视为成功的移植。为了评估人类对移植成功的影响，我们还区分了实验者KB和JT。

脉管系统的形成和连接

对木质部和韧皮部重新连接进行检查，直到手术后7天。为了研究韧皮部的形成，使用了Melnyk开发的协议。

将pSUC2：：GFP幼苗的子叶嫁接到Col-0受体植株上，每天监测根部是否存在GFP荧光。

pSUC2：：GFP系接穗在韧皮部中表达游离的GFP，可以输送到下沉组织。

在野生型根中对GFP的观察证实了接穗和砧木之间韧皮部的重新连接。或者，使用血管示踪剂5-羧基荧光素二乙酸酯来鉴定玉米冠嫁接植物中重新连接的韧皮部或木质部。

对于CFDA测定，Melnyk等人描述的方法与以下修改一起使用。

为了评估韧皮部连通性，将1μl100μM CFDA溶液滴到嫁接子叶上。由于CFDA必须进入活细胞才能成为荧光，因此叶子随后被损坏，以便使用细镊子更好地渗透染料。

一旦CFDA进入组织，它就会通过脉管系统进行特异性运输。1 h后监测根部CFDA。CFDA的快速根部转运通常与韧皮部的移动有关。

为了评估木质部的连通性，将一块石蜡膜M直接放置在豆冠嫁接植物的根部下方，将1μl1mM CFDA溶液滴到根尖上，然后将其切割以获得更好的染料渗透。

1 h后在嫁接子叶中检测到运输的CFDA。CFDA的快速根部到枝部运输通常与通过木质部的移动有关，所有血管测定中的荧光均使用带有GFP滤光片的体视显微镜进行监测。

为了测试对COT嫁接的可能温度影响，在20°C或27°C下进行接枝后的回收。

婴儿床移植的成功和局限性

通过应用已建立的COT移植方案，我们也获得了非常低的成功率，为1.25%，与已发表的成功率相似。

为了提高婴儿床移植的成功率，我们首先建立了基于的下胚轴微移植条件。在下胚轴微移植的成功率超过90%后，我们接下来开发了一种新的子叶微移植切割和连接方法并分析了移植前后的不同条件组合及其各自的成功率。

不同的因素组合导致婴儿床移植成功率从6%到92%不等。最成功的是嫁接前短日照和低光强度与长日照、高光强度、高温和恢复过程中垂直板定位相结合，这种组合导致了高达92%的成功率。

既往报道，短日照条件可提高下胚轴微移植的成功，我们发现这也有利于婴儿床嫁接，在低光强度下生长的植物产生更长的下胚轴和叶柄，植物组织更柔软。

然而，我们注意到，尽管成功率较低，但在嫁接前处理在高光照条件下生长的植物更有效。

在这些条件下，子叶和叶柄的组织更强壮，更有活力。而不是使用在弱光下生长的幼苗每小时 30 株植物，每小时最多可以嫁接 40 株植物。

因此，两种光强度条件导致每小时成功嫁接植物的产量相似。因此，这两种增长条件都是合理的。

此外，幼苗的年龄对手术过程也有很强的影响。一般来说，我们观察到较老和较大的工厂更容易处理，然而，移植成功率不受幼苗年龄的明显影响。

此外，由于这是手工工作，因此不应低估实验者的影响。虽然已知进行下胚轴微移植在技术上具有挑战性，但据观察，由于年轻的拟南芥幼苗的叶柄和子叶叶细腻，因此进行枕头移植可能更加困难。在我们的案例中，实验者之间的成功率不同。

然而，独立于实验者，成功率一直很高。

小板嫁接适用于其他小型植物物种

为了进一步的实际测试，我们将新的COT嫁接方法应用于其他四种植物物种，选择芸苔油菜和茄子来代表较大的植物。

我们无法在芸苔油菜或茄子中生产任何成功的豆苔嫁接植物。移植后2或12天，这些物种的所有移植子叶从受体上分离，下胚轴与膜失去联系。我们假设油菜和石蒜芽孢杆菌幼苗较坚固的下胚轴在其昼夜节律振荡中更有力地启动，因此很容易从潮湿的表面分离。

相比之下，我们成功地将A. suecica和C. rubella嫁接为拟南芥的相似大小的亲戚。我们观察到连接良好的子叶，成功率分别为3.5%和6.36%。

然而，由于我们使用了针对拟南芥优化的条件，因此仍有改进的余地。因此，我们发现这种方法适用于其他小型植物物种。

甚至可以通过像Turnbull等人和Nisar等人之前使用的那样，在移植连接处使用稳定管来改善较大的幼苗。

但是，条件甚至程序都需要针对每个物种分别进行调整。

一般来说，移植是一个具有挑战性的过程，需要实验者的练习、专注和稳定的双手。

将成功率从之前发表的2%提高到92%的关键步骤是在平坦的固体表面上而不是培养基上进行微移植。

此外，调整的切割模式进一步提高了接枝效率，而接枝后的高光强度和高温有利于接枝结合的形成。

与下胚轴微移植类似，韧皮部在木质部之前穿过移植连接处，再生动力学是快速的，值得注意的是，子叶叶柄可以像下胚轴一样快甚至更快地再生血管组织，这表明子叶尽管寿命短，但仍具有很强的再生能力。

成功嫁接子叶维持了子叶在植物发育早期对生物量和叶片产量的显著影响，其他植物物种也可以进行粪便嫁接。

然而，它需要进一步针对特定物种进行调整。