文|名城雨

编辑|名城雨

我们从番茄'Ailsa Craig'中分离出SlNPR1，并使用CRISPR / Cas1系统生成slnpr9突变体。顺式作用元件分析表明，SlNPR1可能参与番茄植株对干旱胁迫的响应。表达模式分析表明，SlNPR1在所有植株组织中均有表达，且受干旱胁迫诱导较强。

因此，我们研究了SlNPR1在番茄-植株耐旱性中的功能。结果表明，slnpr1突变体的耐旱性降低，气孔孔径增大，电解泄漏增加，丙二醛（MDA）和过氧化氢（H2O2）水平，与野生型（WT）植物相比，抗氧化酶的活性水平较低。slnpr1突变体的耐旱性降低进一步反映在干旱相关关键基因（包括SlGST、SlDHN和SlDREB）的表达下调上。

总的来说，数据表明SlNPR1参与调节番茄植株的干旱响应。这些结果有助于进一步了解SlNPR1介导番茄干旱敏感性的分子基础。

干旱是限制植物生长，发育和生存的最恶劣的环境因素之一。由于全球变暖，干旱已成为农业生产中需要紧急解决方案的问题。番茄是世界各地种植的重要蔬菜作物，但其最经济的品种对干旱高度敏感。因此，更深入地探索番茄植株耐旱调控机制是缓解干旱环境损失最有吸引力和可行的选择。

已经确定了一系列参与干旱胁迫或受干旱胁迫影响的生理和生化途径。不利的环境条件严重影响植物，主要是由于活性氧（ROS）的过度积累。抗氧化酶包括抗坏血酸过氧化物酶（APX）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT），在应对连续ROS产生方面起着关键作用。电解质渗漏和丙二醛（MDA）积累可提示干旱胁迫造成的细胞膜损伤。

发病机制相关基因（NPR1，也称为NIM1）的非表达因子是水杨酸（SA）的一种特殊受体，被认为是全身获得性耐药（SAR）的组成部分。NPR1 是一种保守蛋白，具有广复合物、电车轨道和 Bric-a-brac/痘病毒和锌指 （BTB/POZ） 结构域;和Ankyrin重复结构域，这两者都对蛋白质-蛋白质相互作用和使NPR1发挥共激活剂的作用至关重要。

系统发育分析显示，NPR1样蛋白家族有三个功能不同的分支。包括AtNPR1和AtNPR2在内的分支成员经常积极参与SAR监管。然而，包括AtNPR3和AtNPR4在内的分支成员总是与负SAR调节相关，但在安装SAR时是必需的。此外，属于另一个分支的AtBOP1和AtBOP2与侧器官的发育有关。

以前的报告表明，拟南芥NPR1（AtNPR1）正向调节植物对生物胁迫的反应。在感染之前，NPR1蛋白在细胞质中以氧化寡聚形式存在。一旦病原体感染，SA积累会导致细胞内氧化还原电位的变化，这使得NPR1能够易位到细胞核中并与TGA-bZIP转录因子相互作用，激活多种发病机制相关（PR）基因。

AtNPR1或其直系同源物的过表达增强了转基因拟南芥、胡萝卜、柑橘、苹果和葡萄植物的抗病性。然而，关于NPR1对植物非生物胁迫响应的影响的信息仍然有限。最近关于拟南芥的报告表明，AtNPR1通过与HSFA1因子相互作用参与冷驯化。

NPR1依赖性SA信号通路对于增强拟南芥对盐和氧化应激的耐受性至关重要。AtNPR1在烟草植株中的异源表达可以增强对氧化应激的耐受性。此外，在干旱处理的苹果树的叶子中显示出抑制的MdNPR1转录。相反，水稻中AtNPR1的过表达被证明对盐胁迫和干旱胁迫过敏。这些明显矛盾的结果质疑NPR1基因在植物耐旱中介中的作用。

番茄是一种非常受欢迎的作物，因为它具有很高的营养和商业价值，它也经常被用来研究基因功能。因此，为了进一步提高我们对NPR1在植物中功能的认识，有必要表征SlNPR1在番茄植株耐旱中的功能。

在这项研究中，我们从番茄'Ailsa Craig'中分离出SlNPR1，研究了其在所有植物组织和干旱胁迫下的表达谱。簇规则间隔短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关蛋白-9核酸酶（Cas9）技术因其高效率、低成本和设计灵活性而已用于基础科学、医学和农业的多个研究和商业开发领域。

我们使用生物信息学分析来预测SlNPR1的功能，然后使用CRISPR / Cas1系统生成slnpr9突变体。此外，为了发现SlNPR1介导的可能的调控机制，我们通过分析气孔闭合、膜损伤、抗氧化酶活性和干旱相关基因表达，比较了slnpr1突变体（L16、L21和L62）和野生型（WT）植物在生理和分子水平上的耐旱性。研究结果为番茄植株SlNPR1介导干旱调控机制提供了依据。

SlNPR1从Solanum lycopersicum 'Ailsa Craig'克隆并测序（入藏号：KX198701）。SlNPR1由1731bp组成，编码具有576个氨基酸残基的假定蛋白质，预测分子量为64.2 kDa，计算的pI为5.70。对来自番茄的三种NPR1同源蛋白（SlNPR1，SlNML1和SlNML2）以及来自其他植物物种的32种NPR1蛋白进行了系统发育分析。

结果表明，SlNPR1与烟草中的NtNPR1（89%同一性，94%相似性）和甜椒的CaNPR1（91%同一性，95%相似性）以及葡萄的VvNPR1和水稻的OsNPR1高度相似，它们都属于包含AtNPR1和AtNPR2的分支。

然而，SlNML1和SlNML2与AtNPR3和AtNPR4形成了一个独特的分支，它们与AtNPR3相似（分别为58%同一性，73%相似性和51%同一性，70%相似性）。与SlNML1和SlNML2相比，SlNPR1与AtNPR1的相似度最高（53%的同一性，72%的相似性）。

外显子/内含子结构分析表明番茄和拟南芥的NPR1同源基因之间的相似性。它们都包含三个内含子和四个外显子。有趣的是，番茄NPR1相邻外显子之间的距离比拟南芥中的距离长得多。结构域组成分析显示，从番茄和拟南芥中鉴定出的NPR1同源蛋白具有高度保守的结构域。它们都包含BTB / POZ基序，ANK重复和相似位置的C端反式激活结构域。

此外，SlNPR1的N末端区域含有IκB样磷酸基序，已被证明通过磷酸化AtNPR1中的残基Ser11/Ser15来促进NPR1的周转。在SlNPR1的C末端区域也发现了完全保守的五氨基酸基序（LENRV）。它是烟草中NIM相互作用（NIMIN）1/2蛋白的结合位点。然而，AtNPR1的核定位信号序列基序在SlNPR1中并不完全保守。

为了更好地了解SlNPR1在植物对干旱胁迫的反应中的作用，我们使用CRISPR / Cas1基因编辑技术生成了slnpr9突变体。为SlNPR1设计了两个靶点靶点2和靶标1，通过农杆菌介导的转化获得了45株T0非依赖性转基因植株。

此外，T1 代中还存在嵌合、双等位、杂合和纯合 slnpr0 突变体。为了进一步验证slnpr1突变体的编辑类型，对这些独立的转基因系进行了测序分析，两个目标序列的编辑率为46.67%（目标1）和33.33%（目标2）。

在四种编辑类型中，杂合突变是最常见的（26.7%，靶点1;17.8%，靶点2），编辑位点经常出现在原间隔相邻基序（PAM）序列上游约3 bp处。此外，大多数编辑类型几乎是在目标位点进行小的插入和删除，这将导致SlNPR1功能通过移帧而丢失。

为了研究CRISPR/Cas9系统产生的突变是否可以在下一代遗传，我们随机选择了源自相应T1转基因系CR-NPR0-1、CR-NPR16-1和CR-NPR21-1（L62、L16和L21）的T62代进行编辑类型分析。在所有T1转基因植物中，只有一种源自L1的T16代转基因植物是WT。

虽然源自L21的两种植物未能在目标2中进行编辑，但它们在目标1中进行了编辑，同时，为确定靶基因（SlNPR1）的准确性，对T1代转基因株系进行脱靶分析。结果表明，在T1代工厂的任何潜在脱靶位点均未观察到突变，这表明CRISPR / Cas9介导的诱变对SlNPR1具有高度特异性。因此，来自L1，L16和L21的确定的T62代转基因植物用于进一步研究。

干旱胁迫下番茄植株表现出SlNPR1表达的波动性，干旱胁迫后5 h观察到最大值（17.48倍）。结果表明，SlNPR1可能参与对干旱胁迫的响应。此外，还测量了不同组织中SlNPR1的转录水平，以研究其是否具有任何组织特异性。从45周龄WT植株上分离根、茎、叶样品，花瓣完全展开时采集花样，开花后1 d采集果实样品。结果表明，SlNPR3在所有组织中均有表达，在花中表达最高。

为了在分子水平上更好地理解SlNPR1介导的耐旱调控机制，分析了正常和干旱条件下转基因和WT植株中几种干旱相关基因的表达水平。与WT植株相比，转基因株系L16、L21和L62在PEG处理3 d后SlGST表达水平较低，分别比WT植株低52%、60%和54%。

干旱胁迫3 d后，slnpr1突变体中SlDHN的相对表达显著低于WT，此外，在干旱胁迫下，SlNPR1敲除显著降低了SlDREB的相对表达，PEG处理后3 d，L16、L21和L62的表达值分别比WT低33%、43%和32%。

来源于L1、L16和L21的T62代植物的编辑类型表明，T0世代编辑的等位基因是可遗传的，但传递与孟德尔遗传并不完全吻合。先前在水稻和拟南芥中的发现支持了这一点，即早期世代的大多数突变发生在体细胞中。 此外，携带野生型等位基因的T0代杂合系以一些新的编辑类型传递到T1代，在拟南芥中也发现了类似的结果。

观察到slnpr1突变体和WT植株叶片表面造口的微观结构，slnpr1突变体中较高的气孔孔径与拟南芥的报道一致，即AtNPR1在气孔闭合信号通路中起重要作用。进一步确认slnpr1突变体和WT植株之间的显着差异表型。

首先，细胞膜已被提出作为环境应激的主要关键靶点，由这种应激引起的许多生理症状本质上与膜损伤有关。测量电解泄漏和MDA含量，脂质过氧化和氧化应激的指标，以评估膜完整性。slnpr1突变体中较高的电解泄漏和MDA含量表明敲除SlNPR1增强了干旱胁迫引起的氧化损伤。

此外，膜损伤总是由干旱胁迫下ROS的积累引起的，这与较高的H2O2在SLNPR1突变体中观察到的含量，结果表明，SlNPR1功能的丧失导致ROS产量过剩，增强了番茄植株对氧化损伤的敏感性，降低了耐旱性。

综上所述，SlNPR1受干旱胁迫诱导较强，在根、茎、叶、花和果实中均有表达。此外，slnpr1突变体以更高的H2O2以及MDA含量和电解泄漏，表明SlNPR1敲除可能导致更严重的氧化损伤和细胞膜损伤。

抗氧化酶（APX、CAT、POD和SOD）活性水平和SlGST相对表达的下调表明，干旱条件下SlNPR1功能的丧失导致抗氧化基因和抗氧化酶系统的抑制。RT-qPCR分析显示，干旱相关基因（包括SlGST，SlDHN和SlDREB）的转录受到SlNPR1敲除的调节。干旱胁迫下SlNPR1与ABA信号通路的特殊关系将进一步研究。这项研究和进一步的研究将为SlNPR1介导的耐旱调节机制提供见解，并有助于更好地理解SlNPR1在响应非生物胁迫中的作用。