拟南芥DNA的提取、图位克隆以及大肠杆菌感受态的制备

拟南芥（Arabidopsisthaliana）Col-0野生型。拟南芥（Arabidopsisthaliana）Ler野生型。叶绿素荧光异常突变体cfa。

实验所用的菌株与载体

大肠杆菌（Escherichiacoli）DH5α、农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens）GV3101以及空载p-super1300+。

实验药品和试剂

培养基及溶液的配制与培养基的配制

溶液的配制

常用抗生素的配制

实验方法：拟南芥的栽培

将拟南芥种子用0.1%升汞消毒5min左右，无菌水洗涤种子5-8次，之后均匀地点在MS固体培养基上，放入4℃冰箱中进行春化（时间约为2-4d），之后将培养皿放入材料室内（16h光照/8h黑暗，温度为18-22℃，光照强度为120-150μM/m-2s-1，相对湿度80%）培养15d左右。之后将幼苗移到配好的营养土中（营养土/蛭石为1：1左右）。用塑料罩将苗盖住生长两周左右再去掉罩子，持续关注植株生长情况，及时补充水分。

拟南芥的杂交

（1）母本：选择花蕾露白的植株作为母本，用杂交镊子小心剥掉花萼等其余部分，只留有柱头。

（2）父本：选择完全开放的花朵作为父本。

（3）杂交：应在每天11:00-14:00进行该项实验。用杂交镊子小心剥掉父本的花萼、花瓣等结构，只留下花丝，在母本柱头上进行授粉过程。授粉结束后去掉该植株上其它花蕾和果荚，用红线绑在上面做标记，并用一次性手套套在柱头上。

叶绿素含量的测定

（1）取生长两周左右的野生型及突变体植株的同轮叶片，各称量0.02g，分别放入用锡箔纸包裹的EP管中。

（2）在EP管中加入3mL95%的乙醇，42℃恒温水浴锅中进行温育，至少3h。

（3）借助酶标仪测定470nm，649nm和665nm的吸光值，按照特定的公式来计算叶绿素的含量[65]。

叶绿素荧光成像仪的相关参数

拟南芥DNA的提取

（1）剪取幼嫩的拟南芥叶片1-2片，放入标有序号的1.5mLEP管中。

（2）为了防止在研磨过程中有提取液的溢出，先加入少量的DNA提取液100μL，用研磨棒充分研磨。

（3）再加入600μL的DNA提取液，上下颠倒混合均匀。（4）在高速离心机中离心，4℃，15min，12000rpm。

（5）把EP管中的上层水相转移到新的标有相应序号的EP管中，加入700μL的异丙醇（与加入DNA提取液的总体积相同），上下颠倒混匀。放置于-20℃冰箱中，使DNA沉淀40min或以上。

（6）在高速离心机中离心，4℃，10min，12000rpm，沉淀DNA，弃上清。

（7）加入1mL70%的乙醇洗涤，在4℃高速离心机中，12000rpm离心5min。

（8）将上一步骤重复一次，洗去DNA中的杂质。

（9）将EP管倒置在吸水纸上，当残液流尽后，加入20μL60℃去离子水，待DNA完全溶解后，放入-20℃冰箱中保存。

琼脂糖凝胶的配制

（1）首先本实验中经常用到的是4%的琼脂糖凝胶。

（2）称量4g琼脂糖倒入250mL的锥形瓶中，再用量筒量取100mL1×TAE缓冲液也倒入该锥形瓶中，微波炉加热1min左右（加热的时候应用一个一次性手套套住锥形瓶瓶口，以免电泳液流出），摇晃锥形瓶（可以加速琼脂糖的溶解），再继续加热直至充分溶解。

（3）加入4-6µL的EB，摇匀，倒在模具上，将选取好的大小合适的梳子插在模具上，室温放置20min左右。

（4）向电泳槽中倒入新配置的1×TAE电泳缓冲液，并把琼脂糖凝胶放入电泳槽中，将扩增好的样品加入胶孔中。

（5）150V跑电泳，由于在4%琼脂糖凝胶中，电泳速度较慢，约20min后停止电泳。

凝胶成像仪下扫胶并保存图片以便后续分析。

拟南芥RNA的提取

（1）首先用DEPC水浸泡实验要用到的枪头和EP管，在实验开始前，要对实验台、研钵和药匙进行消毒，并向研钵中加入95%的酒精，把研磨棒和药匙放入研钵中进行热消毒。

（2）根据实验的具体要求，称量拟南芥组织部位0.1g，用锡箔纸包裹放入液氮中速冻。先将研钵预冷，在研钵中将材料研磨至粉末，在研磨过程中，要使材料处于液氮环境中。

（3）把研磨好的粉末，用药匙移至1.5mLEP管中，加入1mLTrizol,剧烈的上下震荡15s，将充分振荡后的样品放置于冰盒中（5min以上）。

（4）加入氯仿200μL，剧烈振荡，15s，放置于冰盒中（2min以上）。

（5）在高速离心机中离心，4℃，12000rpm，15min。

（6）取新的EP管并做好标记，将吸取的上清液（注意吸取过程一定要小心，枪头不能碰到白色分层处）转入EP管中。

并将同等体积的异丙醇加入到EP管中，上下颠倒（注意动作一定要轻柔）。将样品放置于冰箱-20℃中30min。

（7）在高速离心机中离心，4℃，12000rpm，10min。

（8）去上清，沉淀用1mL75%乙醇（用DEPC水现配现用）洗涤。在离心机中离心，4℃，7500rpm，5min。

（9）重复第七步。

（10）去上清，用小枪尽量将沉淀周围的残留液吸净。将离心管放入真空仪中抽干（5分钟左右）。加入DEPC水，保存于超低温冰箱中。

拟南芥RNA反转录c DNA

反应体系：

半定量RT-PCR实验

在拟南芥RNA反转为cDNA后，取1.0L模板cDNA然后加入9.0LddH2O对模板进行稀释，用Actin引物对稀释好的模板进行PCR扩增，将扩增好的产物加入溴酚蓝后进行电泳检测，分析目的基因表达量。

拟南芥基因的图位克隆

（1）图位克隆引物

根据相关生物学网站提供的引物序列，或者若该序列不合适（如以Col-0野生型和Ler野生型扩出的条带大小差异小于10bp，则该引物不可用）就重新设计引物。拿到引物后，首先用Col-0野生型和Ler野生型DNA作为模板进行PCR扩增，若扩增出的条带明显不在同一位置上，并且用杂交成功的F1代植株DNA作为模板能够扩增出上下明显的两条带，则这对引物能用于图位克隆的定位工作。

本实验用到的图位克隆粗定位引物序列如表3-1：

首先通过粗定位确定目的基因在某条染色体上的大概位置，在这个位置的上下游开发新的Marker，继续进行PCR的扩增，计算重组率，最终确定突变位点。

本实验用到的图位克隆细定位引物序列如表3-2：

（2）图位克隆PCR实验体系与重组率的计算

在每次进行PCR扩增时，都要以Col-0野生型和Ler野生型为模板进行扩增以作为参照。若以筛选出的F2代突变体DNA为模板扩增出了与Col-0野生型大小一致的条带，说明没有发生交换；若扩增出了与Ler野生型大小一致的条带，说明发生了双交换；若以F2代突变体DNA为模板扩增出了两条带，一条带的大小与Col-0野生型一致，另一条带的大小与Ler野生型一致，则说明发生了单交换。统计样品总数、单交换的个数和双交换的个数，按照公式计算重组率。

载体构建

1. 用KOD酶扩增目的片段的PCR反应体系：

（2）PCR反应程序：

注明：引物的退火温度应根据Tm值调整，按所扩增片段的大小确定延伸时间。

1. 双酶切体系：

1. 酶切产物的连接：

大肠杆菌感受态的制备

（1）用接种环挑取DH5α菌液，在不加任何抗生素的LB板上按“Z”字型划线（使菌种复苏）。

（2）将平板倒置过夜培养（37℃培养箱中）。

（3）在4mL的LB液体培养基中接种一个单菌落，进行小摇过夜培养（37℃，220rpm）。

（4）在200mLLB液体培养基中加入1mL小摇后的培养液，进行大摇，培养3-6h左右（37℃，220rpm）。

（5）根据菌液的颜色变化，检测菌液的OD值，当OD600达到0.3-0.5时（大肠杆菌的OD在此范围内，活性比较高），冰浴30min。

（6）在高速离心机中离心，4℃，15min，4000rpm。

（7）去上清，收集沉淀（该沉淀即为菌体），用10mL预冷的0.1mol/LCaCl2重悬沉淀（注意沉淀需充分悬浮），冰上放置15min。

在高速离心机中离心，4℃，4000rpm，15min。

（8）把0.1mol/LCaCl2（含15%的甘油）提前放入冰箱中预冷，取2mL重悬沉淀。用枪头将沉淀吹打均匀后即可分装。

（9）每个EP管中加入200μL的感受态细胞，迅速放入液氮中，待结束分装后放入超低温冰箱中保存。

大肠杆菌感受态的转化

（1）从超低温冰箱中取出感受态细胞后放到冰上约5min，待其自然溶解后，用移液器将连接产物转移到含有感受态细胞的EP管中，将该EP管放于冰上30min。

（2）在恒温水浴锅中，42℃，热激90s，再将EP管迅速插入冰中，静置5min。

（3）将1mLLB液体培养基（不含任何抗生素）加入该EP管中，在摇床中培养1h，37℃，180rpm。

（4）室温下离心，4000rpm，5min，在超净台中用大枪吸走900μL左右的培养液，再换成中枪重悬细胞沉淀。

混合均匀后，用枪吸出混合液并打到LB固体培养基上（含有抗生素），用提前加热消毒过的涂布棒（涂布棒的温度与室温基本相同）将混匀的混合物涂匀即可。

将培养皿倒置放入培养箱中（37℃，过夜），第二天若有菌落长出即可挑取单菌落进行PCR验证。重组菌落与质粒的鉴定阳性模板为LB固体培养基上长出的单菌落，阴性模板为无菌的去离子水。用Taq酶对其进行PCR扩增即可（PCR反应体系与扩增目的基因片段的相同）。

将扩增后的产物进行电泳检测（跑胶过程中应加入大小合适的Marker），若扩增的条带大小和目的基因片段的相同，则该单菌落为潜在的阳性菌落。用灭过菌的小枪头挑取阳性菌落后，接种在LB液体培养基中（含有抗生素），过夜培养后，用试剂盒提取质粒。取10L的质粒进行双酶切验证（加入的酶量和其他药品量应减少，以免浪费药品），酶切完成后进行电泳检测，电泳检测时在胶孔中加入目的基因及空载作为参照。若质粒酶切后出现两条带，一条与目的基因大小相同，另一条与空载大小相同，则证明该重组质粒就是我们要构建的质粒，接着取一定量的质粒与引物送到测序公司进行测序比对，防止错配情况的出现。

参考文献