种植体的结构(基质形貌如何影响hBMSCs的成骨分化？《ACS AMI》或许可以给你启发)

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种植体表面的微观结构是决定骨整合种植体长期稳定性的关键因素。目前，具有粗糙表面的植入物的使用已经被证明对于改善手术放置的植入物和骨组织之间的稳定结合是有效的。其中，MSCs谱系定向受到培养基质微结构的影响，因此，设计合适的骨科植入物表面形貌进而引导MSC成骨分化来改善骨整合是一种有效的策略。

基于此，来自德国柏林自由大学的Andreas Lendlein、Nan Ma团队阐释了细胞活性和聚碳酸酯(PC)基模型基板表面微观结构之间的关系。受人类松质骨微结构的启发，假设平均峰间距(Sm)与松质骨孔径相当的2.5D粗糙表面基底可能通过提供类似于松质骨的结构微环境来改善hBMSC成骨分化（图1a）。作者选择聚碳酸酯(PC)是因为其高生物相容性、透明性和弹性模量与天然人类小梁相当，并使用具有光滑表面(sPC)的插入物作为对照。作者研究了形貌信号从细胞-物质界面到细胞质和细胞核的传递，评估hBMSCs在基质上的成骨分化。

相关研究成果以“3D-Bioprinted Biomimetic Multilayer Implants Comprising Microfragmented Adipose Extracellular Matrix and Cells Improve Wound Healing in a Murine Model of Full-Thickness Skin Defects”为题于近期发表在《ACS Appl. Mater. Interfaces》上。

1. 基底形貌的表征及其调节hBMSC分化

嵌入件由PC制成，底部具有不同的微观结构（图1C），并通过光学轮廓测定法和AFM对其进行了表征。mPC基底的Sm值（160.3±8.2 μm）与单个hBMSC的尺寸相当，hPC的Sm值（279.3±32.3 μm）与小梁骨的孔径相似。在纳米尺度上，所有基材的粗糙度Ra均小于5 nm。

图1 使用具有仿生表面形貌线索的2.5D基质调节hBMSC分化

作者检查了hBMSC的成骨和脂肪形成分化，以验证地形信号是否可以调节hBMSC分化。作者检查了混合诱导培养基（MM）中的细胞分化，该培养基含有成骨和脂肪形成诱导成分，以更好地模拟间充质干细胞在体内经历的复杂和动态环境。当细胞在MM中培养时，发现基质微结构对hBMSC分化有类似的影响；培养21天后，在hPC组中观察到最高水平的羟基磷灰石（图1D）、钙沉积（图1E）和OCN表达（图1F）。hPC上的细胞显示出比sPC和mPC上更低的成脂分化水平（图1G）和成脂分化标记物FABP-4的表达显着下调（图1H）。这些结果表明，无论使用何种诱导条件，hPC都会促进hBMSC成骨分化并抑制脂肪形成分化。

2. 基质微观结构调节细胞粘附、细胞骨架形成和细胞收缩性

接着，作者进一步检测了粘着斑复合物、整合素β1亚基激活和FAK磷酸化，所有这些在促进MSC成骨分化和成骨细胞成熟中发挥着重要作用。从实验结果可以观察到hBMSC在hPC基底上表现出更多数量的粘着斑，如纽蛋白染色所证明（图2A）。与sPC相比，在hPC上培养的hBMSC表现出活化的整合素β1和FAK磷酸化水平显着升高（图2B、C）。作者还发现在hPC基质上培养的hBMSC分泌和沉积的纤连蛋白水平高于在sPC和mPC上培养的hBMSC（图2D）。总之，hPC的微观结构可以促进整合素激活及其下游FAK信号传导，并调节ECM蛋白的分泌和分布及其与细胞的相互作用。

此外，F-肌动蛋白的量和组织直接调节细胞硬度和MSC成骨分化，通过抑制F-肌动蛋白解聚可以增强骨形成，相关实验结果表明表面形貌线索影响肌动蛋白聚合和细胞骨架排列（图2F、G）。

图2 hPC表面形貌信号促进hBMSC粘附、肌动蛋白聚合和收缩性

3. hPC基质诱导核变形并增强核骨架

细胞骨架网络通过核骨架和细胞骨架（LINC）复合物的连接体桥接细胞膜和细胞核。这样，机械信号可以直接从细胞/材料界面传输到细胞核。与低细胞内张力下松弛的细胞核相比，机械应力的细胞核因高收缩力而变形。作者在hPC上培养的细胞核明显比其他基质上培养的细胞核“细长”（图3A），并且细胞核长宽比明显更高（图3B）。此外，hPC上的细胞表达的pLamin A/C 水平最低，但Lamin A/C 水平最高（图3C、D、E），表明hPC形貌产生的机械力可以增强核膜上的Lamin A/C并抑制其磷酸化，这与之前的报道一致。使用RGD肽、blebbistatin (Bleb)和细胞松弛素D(Cyto D)阻断表面整合素并抑制肌球蛋白II活性和肌动蛋白聚合，可减少Lamin A/C表达（图3F），表明这些成分在感测机械信号并将其传递至细胞核。

图3 hPC底物增强核伸长和核纤层蛋白A/C富集

4. hPC基质调节YAP核易位和活性

作为机械传感器和机械传感器，Yes相关蛋白（YAP）在介导细胞机械传感过程中发挥着重要作用。与sPC和sPC上的细胞相比，hPC上的细胞表现出更高水平的YAP活性，通过增强的YAP 核定位（图4A）和较低的pYAP/tYAP比率（图4B）来证明。用抑制剂阻断机械转导途径的治疗显着增加了hPC上hBMSC的pYAP/tYAP比率（图4C），这证实了细胞收缩力对YAP活性的影响。这一发现与之前的一项研究一致，即施加到核膜上的机械力导致NPC通透性增强，从而促进机械转导信号分子的输入。

图4 YAP激活和核易位响应底物地形线索

5. hPC基质微观结构调节组蛋白修饰

之后作者检查了在不同基质上培养的细胞的整体H3K27me3和H3K9ac表达水平。当在GM中培养时，与sPC和mPC上的细胞相比，hPC上的细胞在细胞核中呈现出更强的H3K27me3和H3K9ac荧光强度（图5A）。根据定量分析，hPC上的细胞比mPC和sPC上的细胞具有显着更高的H3K27me3/H3和H3K9ac/H3比率（图5B），表明hPC上hBMSC的干性得到提高。

为了在表观遗传水平上鉴定机械转导蛋白的功能，接下来使用抑制剂和siRNA检查了hPC底物上的组蛋白修饰，细胞培养基对整体组蛋白修饰显示出巨大的影响（图5D、E）。

图5 底物地形线索调节全局组蛋白修饰

6. hBMSC分化中的力转导信号级联

最后，作者通过抑制机械力转导级联中涉及的成分，研究了机械力对MM中 hPC上生长的hBMSC分化能力的影响。正如预期的那样，在抑制整合素、肌球蛋白、F-作用或核膜蛋白后，成骨标志物OCN的表达水平显着下降（图6A）。相反，脂肪生成标记物FABP-4的水平在抑制后增加，除了Emerin干扰引起的轻微下降外（图6B）。因此，钙沉积（图6C）被强烈抑制，而脂滴形成（图6D）通过破坏收缩丝或抑制肌动蛋白聚合而增强。

图6 机械力介导hBMSC向骨谱系分化

总之，这些结果表明，具有模仿天然骨小梁的地形线索的hPC基质可以触发细胞内和核内生物信号，并增强hBMSC的成骨分化（图7）。细胞贴壁后，细胞可以感知hPC呈现的独特的形貌线索，例如与骨小梁的峰间距相当的峰间距，然后激活一系列信号通路和功能蛋白。这些包括促进整合素表达和激活、粘着斑形成、FAK磷酸化和下游信号传导。

图7 hPC拓扑信号触发的细胞内和核内信号示意图

综上，受到骨小梁结构的启发，本文设计了平均峰间距与骨小梁孔径相当的2.5D基底。这种底物可以增强hBMSCs粘附和细胞骨架组织并促进细胞骨架张力。细胞骨架张力的增加会导致细胞核变形和组蛋白修饰，从而进一步调节基因表达并指导hBMSC分化谱系。这些发现填补了对细胞与基质相互作用的基本理解中的一个关键空白，并强调了基质地形线索作为调节骨修复和再生中干细胞的重要设计因素。机制研究在表观遗传水平上鉴定了跨膜蛋白、细胞内蛋白和核蛋白等不同成分的功能。特别是，作者证明了YAP和Lamin A/C在力转导过程中分化基因位点组蛋白修饰中的作用。这些结果提出了使用材料与针对YAP和Lamin A/C的生化因子一起使用的前景，以最大限度地发挥干细胞的应用潜力。

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