粉绿狐尾藻 种植(转录组学和生理学分析揭示了粉绿狐尾藻,耐铵机制)

摘要：

研究发现，水生植物粉绿狐尾藻,Myriophyllum aquaticum对水环境中的高铵（）具有很强的抗性，并且对处理猪废水具有很高的效率。为了了解耐受性和毒性机制，我们研究了粉绿狐尾藻对胁迫的转录组学和生理反应。该植物在温室中使用0.2mM 作为对照（N1），在高（10mM:N2）和超高（70mM:N3）浓度的Hoagland溶液中生长，然后进行Illumina下一代测序和PacBio单分子实时测序。N3植株表现出明显的毒性症状，而N1和N2植株在处理两周后表现出旺盛的生长。在N2和N3处理下，共有31678个和35072个差异表达基因在粉绿狐尾藻,中被鉴定。

叶片中捕光叶绿素a/b结合蛋白基因的转录上调导致粉绿狐尾藻对活性氧物种。氮代谢基因的转录下调或上调，包括转运蛋白、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合成酶、谷氨酸脱氢酶和天冬酰胺合成酶基因，在高浓度下通过摄取、运输和同化，对稳态是不可或缺的。我们的研究提供了关于粉绿狐尾藻对胁迫反应的分子和生理机制的见解，我们的多转录组数据库有助于未来对该物种的研究。这些结果为水溶性支原体处理猪废水中的高浓度奠定了理论基础。

前言：

大规模工业规模的畜牧业生产日益成为猪废水的主要来源，对中国农村水环境造成严重污染，尤其是在废水处理不当的地区（Ongley等人，2010年；Sun等人，2012年；Yi等人，2020年）。近年来，人工湿地（CW）因其在修复和净化猪废水方面的作用而日益受到关注（Huang等人，2010年；Shelef等人，2013年；Piwpuan等人，2016年）。然而，高浓度的铵（）是猪废水的主要特征，可达到1000 mg L−1（Nagarajan等人，2019年；Hu等人，2017年），这阻止了猪废水处理的化学武器的广泛实施，因为人工湿地中种植的大多数大型植物对高浓度很敏感（Nimptsch和Pflugmacher，2007年；Su等人，2012年；Zhang等人，2013年；Gao等人，2015年）。因此，应用抗高强度的大型植物是提高人工湿地处理猪废水性能的关键。

粉绿狐尾藻M.aquaticum是一种漂浮或浸没的大型植物，具有从半湿润到半浸没条件的广泛栖息地，因此，在一些国家和地区，它被认为是一种入侵植物（Shen等人，2019）。然而，Li等人（2018）报告称，从其生态适应性、自然竞争力和害虫危害等几个方面来看，粉绿狐尾藻在中国大陆以侵略性规模自然蔓延的风险非常低，且高度可控。由于对的高耐受性和高吸收性，以及生长有粉绿狐尾藻的人工湿地能够高效地从猪废水中去除氮（N）（Zhang等人，2016；Liu等人，2018；Luo等人，2018）。

先前的研究表明，粉绿狐尾藻对外界高浓度的具有诱导性生理反应。发现粉绿狐尾藻组织中的谷氨酰胺合成酶（GS）活性在40mg L−1 时达到峰值，但在用更高的补充剂处理时下降（Zhou等人，2017）。短期内，随着浓度的增加，抗氧化酶超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）的活性显著增加（Gao等人，2019）。作为应激条件下细胞损伤的指标，丙二醛（MDA）浓度在高水平下增加（Zhou等人，2017；Gao等人，2019）。然而，粉绿狐尾藻对高反应的潜在分子机制在很大程度上是未知的。

植物物种对的耐受阈值差异很大，Britto和Kronzucker（2002）报告称，外部浓度高于0.1至0.5 mM时，通常会出现毒性综合征，包括生长发育迟缓、根冠比降低和叶片失绿（Esteban等人，2016），这可能是由于过量的积累造成的，无效跨膜循环的高能量成本，或pH稳态的失调（Britto等人，2001；Marino和Moran，2019）。

植物对的耐受性由多方面决定。铵运输商（AMT）的规定负责的获取，以确保工厂的最佳供应（Lanquar等人，2009年）。体内的可以通过谷氨酰胺合成酶/谷氨酸合成酶（GS/GOGAT）循环被同化为氨基酸，以避免积累（Masclaux Daubesse等人，2010；Yamaya和Kusano，2014）。由于碳骨架是同化的关键，高光照强度通过保持高碳水化合物生物合成速率来提高耐受性（Seti´en等人，2013）。此外，Patterson等人（2010）报道，活性氧（ROS）清除酶有助于减少应激引发的ROS，从而减少诱导的细胞损伤。

近年来，下一代测序技术（RNA-seq）已用于水稻（Oryza sativa）和水生植物浮萍（Lemna minor），以揭示在转录水平上响应高浓度的分子机制（Yang等人，20152020；Wang等人，2016；Sun等人，2017b），但缺乏粉绿狐尾藻的可用基因组参考信息，阻碍了对RNA-seq生成的短而不完整的基因转录本的正确解释和对基因表达的深入研究（Tilgner等人，2015）。在PacBio-Squeel平台上进行的单分子实时（SMRT）测序可以直接产生包含5'UTR、3'UTR和poly-A尾部的完整mRNA转录本，而不会中断剪接。该转录组水平的参考序列为后续研究提供了良好的遗传信息基础（VanBuren等人，2015；Lan等人，2017）。

我们先前的多重水平实验表明，0.2mM 可以支持粉绿狐尾藻的正常生长，并且当外部浓度从第21天起超过10mM时，粉绿狐尾藻相对生长速率开始略有下降（Li等人，数据未公开）。在此，设定0.2mM 作为对照，10mM 用作耐受浓度，并且施加70mM以模拟猪废水的真实场景。在水培系统中设置这三种浓度。利用SMRT测序和RNA-seq技术、叶绿素测量、酶和氨基酸测定以及荧光探针染色来实现以下目的：（1）获得所有转录物的完整信息，并构建粉绿狐尾藻的长读SMRT文库；（2） 在高浓度下鉴定差异表达基因（DEG），并筛选参与耐受的关键基因；（3） 阐明了对高和超高浓度的不同转录组和生理反应。因此，我们将揭示粉绿狐尾藻叶、茎和根中对高的潜在耐受机制，这有利于更好地利用粉绿狐尾藻处理猪废水。此外，对提高高氮背景下作物氮素利用效率具有重要的指导价值。